А. Д. Тяпкина, В. Д. Горичева
На живые организмы оказывают влияние различные факторы внешней среды. При экстремальных воздействиях, к которым относятся перегревание и переохлаждение организма, происходят изменения гомеостатических констант, и прежде всего относящихся к системе крови [1]. Лейкоциты, имеющие высокую реактивность, быстро включаются в реакции адаптации.
Целью проведенного исследования было комплексное изучение функциональных свойств лейкоцитов при перегревании и переохлаждении организма.
Материал и методы исследования
Опыты проведены на лабораторных белых крысах (90 животных) с исходной массой тела 330-400 г. В эксперименте было выделено 7 групп животных: две интактные, служившие контролем, и 5 экспериментальных: 1 группа - легкая степень теплового поражения, 2 - средняя степень теплового поражения, 3 группа - тяжелая степень теплового поражения, 4 группа - переохлаждение организма, 5 группа - переохлаждение организма в условиях алкогольной интоксикации. Три первых группы животных выдерживали в термокамере при t +400С без доступа к воде. Животных 4-й и 5-й групп подвергали охлаждению в воде температурой +15°С. Животным 5-й группы дополнительно вводили в пищевод через эластичный зонд этиловый спирт (30%) в количестве 1 мл на 100г массы тела.
Смешанную кровь для исследования брали путем декапитации у предварительно наркотизированных животных. Для предотвращения свёртывания использовали гепарин в количестве 10 ед/мл. Полученную кровь центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин. Собирали лейкоциты. Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония. Клетки дважды отмывали изотоническим буфером (раствор Дюльбекко). Отмытые клетки ресуспендировали и подсчитывали их концентрацию в камере Горяева.
Фагоцитоз
Для исследования поглотительной способности нейтрофилов использовали частицы латекса размером 0,8 мкм. Смесь лейкоцитов с латексом в соотношении 1: 50 инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин., встряхивая пробирку с лейкоконцентратом через каждые 5 мин. Затем в фиксированных метанолом и окрашенных азур-эозином мазках подсчитывали процент фагоцитирующих клеток (фагоцитарная активность, ФА) и среднее число поглощенных частиц (фагоцитарный индекс, ФИ) [2].
Миграционная активность
Для постановки миграции под агарозой использовали классический вариант, описанный в многочисленных монографиях и статьях. Агарозу с добавлением культуральной клеточной среды 199 наслаивали на предметные стекла. Для оценки спонтанной миграции в агаровом геле с помощью пробойника вырезали одну лунку, в которую помещали суспензию лейкоцитов (7-10x105клеток). На втором стекле ставили реакцию индуцированной миграции. Для этого вырезали группу из двух расположенных на расстоянии, равном диаметру пробойника (2,5 мм), лунок: одну - для клеточной суспензии, вторую - для хемоаттрактанта. В качестве хемоаттрактанта использовалась свежая плазма крови. Стекла помещали во влажную камеру при 37°С в атмосфере воздуха с 5% содержанием СО2 на 2 часа, затем погружали в 2% раствор глутарового альдегида на 60 мин. После фиксации и удаления агарозы клетки окрашивали азур-эозином по Романовскому. В обоих случаях для оценки локомоционной активности измеряли площадь распространения клеток и рассчитывали хемотаксический дифференциал - отношение изменений площади индуцированной миграции по сравнению со спонтанной к площади клеточного ареала при самопроизвольной миграции (%) [3].
Адгезионная способность
За основу проводимых манипуляций была взята методика, описанная Megе J.-L. с соавт. 40 мкл суспензии лейкоцитов помещали в капилляр с внутренним диаметром 0,56 мм, предварительно обработанный аутоплазмой. Клетки инкубировали во влажной камере при 370С в течение 60 мин. Дальнейшие процедуры были следующими. Клеточную взвесь осторожно удаляли из капилляра при напряжении сдвига около 0,1 Н/м2. Капилляр повторно заполняли раствором Дюльбекко и освобождали от содержимого при напряжении сдвига 30 Н/м2. Считали число клеток в исходной суспензии, а также первом (неадгезировавшие и с малой силой сцепления) и втором (со средней силой сцепления) смыве. Из полученных данных рассчитывали число клеток, оставшихся в капилляре (с большой силой сцепления) [4].
Результаты исследований и их обсуждение
В ходе исследований были получены следующие результаты.
Изменения поглотительной способности нейтрофилов в условиях гипертермии выявили поэтапное увеличение фагоцитарной активности и числа поглощенных частиц (табл. 1). Прирост изученных показателей по сравнению с контролем составил: 20 минут перегревания - ФА - 8%, ФИ - 7%; 75 минут - ФА - 16%, ФИ - 37%; 120 минут - ФА - 24%, ФИ - 52%. При охлаждении животных до состояния холодного наркоза фагоцитарная активность менялась незначительно (1%), а число поглощенных частиц возрастало (увеличение ФИ - 19%). Охлаждение в условиях алкогольной интоксикации негативно сказывалось на функциональной активности нейтрофилов: достоверно снижались оба показателя ФА - 10%, ФИ - 37% (табл. 2).
Таблица 1
Показатели фагоцитарной активности у животных, подвергавшихся перегреванию
| Группа | Фагоцитарная активность(%) | Фагоцитарный индекс (отн. ед.) |
| Контроль | 75±1,7 | 7,5±0,4 |
| I группа животных | 81±0,8 * | 8,0±0,2* |
| II группа животных | 87±1,1 * | 10,3±0,3* |
| III группа животных | 93±0,7 * | 11,4±0,4* |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,05).
Таблица 2
Показатели фагоцитарной активности у животных, подвергавшихся переохлаждению
| Группа | Фагоцитарная активность (%) | Фагоцитарный индекс (отн. ед.) |
| Контроль | 92,8±1,01 | 9,3±0,3 |
| IV группа животных | 91,5±1,03 | 11,1±0,46 ** |
| V группа животных | 84,1±1,28 ** | 8,0±0,49
* |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,05);
** - достоверность различий по сравнению с контролем (p<0,01).
Неодинаково выраженные при различном действии температурного фактора и инвертированные при алкогольной интоксикации изменения фагоцитарной активности лейкоцитов отражают, видимо, специфические черты процесса, вызванного экстремальным агентом. Вероятно, в данном случае происходят гормональные и медиаторные сдвиги, а также изменяются чувствительность и сопротивляемость белых клеток крови.
Изменения миграционных реакций имели ту же направленность. Из приведенных данных (табл. 3,4) видно, что при средней степени теплового поражения спонтанная миграционная активность возрастала на 37%, а реакции хемокинеза в присутствии свежей сыворотки крови были менее выражены, чем у интактных животных. При охлаждении животных до признаков холодного наркоза миграционные реакции нейтрофилов практически не отличались от контроля, и сочетание охлаждения с дачей этилового спирта приводило к повышению хемотаксической активности.
Таблица 3
Миграционная активность лейкоцитов животных, подвергавшихся перегреванию
| Группа | Площадь распространения клеток при спонтанной миграции (мм2) | Площадь распространения клеток при стимулированной миграции (мм2) | Хемотаксический дифференциал (%) |
| Контроль | 3,5±0,2 | 3,7±0,2 | 6,9±1,1 |
| I группа | 4,1±0,2* | 4,2±0,2* | 4,1±5,5* |
| II группа | 4,8±0,2* | 4,9±0,2* | 1,5±1,9* |
| III группа | 5,0±0,2* | 4,7±0,3* | -7,1±3,1* |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контрольной группой (p< 0,05).
Таблица 4
Миграционная активность лейкоцитов животных, подвергавшихся переохлаждению
| Группа | Площадь распространения клеток при спонтанной миграции (мм2) | Площадь распространения клеток при стимулированной миграции (мм 2) | Хемотаксический дифференциал (%) |
| Контроль | 4,2±0,2 | 4,2±0,4 | 9,1±6,6 |
| IV группа животных | 4,6±0,2 | 4,6±0,3 | 4,5±10,2 |
| V группа животных | 4,7±0,3 | 5,6±0,3** | 22,8±7,4 |
Примечание: ** - достоверность различий по сравнению с контрольной группой (p<0,01).
Изменения адгезионной способности лейкоцитов в условиях экзогенного перегревания носили фазный характер (табл. 5). Соотношение числа лейкоцитов с высокой и средней силой сцепления менялось в сторону увеличения последних. При охлаждении животных адгезионная способность лейкоцитов снижалась (56%) преимущественно за счет клеток с высокой силой сцепления. Сочетание охлаждения с дачей алкоголя приводило к возвращению числа адгезировавших клеток к уровню контрольной группы (табл. 6). Данный стабилизирующий эффект связан, по-видимому, с гуморальными сдвигами, опосредуемыми этиловым спиртом.
Таблица 5
Изменение адгезионной способности лейкоцитов животных, подвергавшихся перегреванию
| Группа | Доля неадгезировавших клеток (%) | Доля клеток со средней силой сцепления (%) | Доля клеток с высокой силой сцепления (%) |
| Контроль | 43,3±4,1 | 5,9±1,1 | 50,8±4,3 |
| I группа животных | 34,7±6,3* | 13,3±3,6 | 52,1±5,5 |
| II группа животных | 42,3±6,5* | 15,6±4,7 | 42,1±6,7 |
| III группа животных | 18,6±6,9* | 7,0±2,7 | 74,3±6,6 |
Примечание: * - достоверность различий с контролем, p<0,05.
Таблица 6
Изменения адгезионной способности лейкоцитов животных, подвергавшихся переохлаждению
| Группа | Доля неадгезировавших клеток (%) | Доля клеток со средней силой сцепления (%) | Доля клеток с высокой силой сцепления (%) |
| Контроль | 32,2±4,6 | 11,5±2,1 | 56,1±6,2 |
| IV группа животных | 50,3±3,.9 | 10,6±0,9 | 39,1±4,4* |
| V группа животных | 29,3±3,9 | 13,1±1,9 | 57,6±5,7 |
Примечание: ** - достоверность различий с контролем, p<0,01.
Проведённое исследование показало, что для состояния экзогенного перегревания организма характерны более выраженные изменения функциональной активности нейтрофилов, чем для состояния охлаждения. Эти различия обусловлены, скорее всего, увеличением температуры тела "перегретых" животных. Температурный фактор играет роль модулятора, запускающего защитные реакции организма. Этиловый спирт в условиях охлаждения белых крыс выступает в качестве стабилизатора постоянства внутренней среды организма.
Список литературы
Новиков В.С. Проблема экстремальных состояний человека // XVII съезд Всерос. физиолог. общества им. И.П. Павлова: Тезисы докладов. Ростов-на-Дону,1998. С.85-85.
Потапов С.Г., Хрустиков В.С., Демидова Н.В., Козинец Г.И. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса // Пробл. гематол. и переливания крови. 1977. Т.22. № 9. С.58-59
Соколова Т.Ф., Редькин Ю.В. Изучение спонтанной миграционной активности лейкоцитов под агаровым покрытием // Лаб. дело. 1983. № 1. С.31-33
Mege J., Eon B.,Saux P. Et al. Ynhibition of granulocyte Adhesion by Pentoxifylline and Analogyues: Effects of Leukocyte function // Proceedings of the Workshjp. France, Saint Paul-de-Vence, 1989. P. 17-23