федеральное агентство по образованию
ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.Г. БЕЛИНСКОГО
Принято на заседании Ученого совета Естественно-географического факультета протокол № ___от «___» _________2006 г.
Декан факультета ________________
Л.В. Кривошеева
УТВЕРЖДАЮ
Проректор по учебной работе
______________________________
М.А. Пятин
УЧЕБНАЯ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА
по дисциплине «
Биотехнология
»
для специальности
020208 (012300)– «Биохимия»
Факультет естественно-географический
Кафедра биохимии
Пенза, 2006 год
ТРЕБОВАНИЯ ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО СТАНДАРТА ПО ДИСЦИПЛИНЕ
| Индекс | Наименование дисциплины и ее основные разделы | Всего часов |
| ДС.00 | Специальные дисциплины и дисциплины специализации |
|
| ДС.Ф.00 | Федеральный компонент | |
| ДС.Ф.09 | Биотехнология Задачи и методы биотехнологии; генетическая инже-нерия; иммобилизованные ферменты и их применение в биотехнологии. |
50 |
КВАЛИФИКАЦИОННЫЕ ТРЕБОВАНИЯ
Подготовка специалиста-биохимика проводится на биологических факультетах или отделениях, на кафедрах биохимии. Реализация основной образовательной программы специалиста биохимика должна обеспечиваться преподавателями, имеющими базовое образование и/или опыт работы и публикации по профилю преподаваемых дисциплин, систематически ведущих научную и научно-методическую работу, подтвержденную публикациями. Доля преподавателей с учеными степенями и званиями должна быть не менее 67%. Преподаватели специальных дисциплин, как правило, должны иметь ученую степень и опыт деятельности в соответствующей профессиональной сфере.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ
Курс “Биотехнология” призван ознакомить студентов с принципами применения биологических знаний в производстве практически важных продуктов и приобрести понятие о современных технологических процессах, базирующихся на генетической и клеточной инженерии.
Целью изучения дисциплины является ознакомить студентов с принципами применения биологических знаний в производстве практически ценных продуктов и приобрести системные знания о современных технологических процессах, базирующихся на генетической и клеточной инженерии.
Биотехнология применяет методы, заимствованные из химии, биохимии, микробиологии, молекулярной биологии, химической технологии и компьютерной техники для создания высокорентабельных процессов, производства биологически активных веществ различного назначения.
Одна из главных причин успехов в биотехнологии – прогресс молекулярной биологии, в частности в разработке технологии рекомбинатных ДНК. Эта технология позволяет манипулировать с наследственным материалом клетки, получая новые сочетания полезных признаков и способностей.
В лекционном курсе «Биотехнология» рассматривается разнообразие мира микроорганизмов, их место в биологической эволюции, рост и развитие микроорганизмов, основные физиологические и биохимические свойства, способы культивирования и методы генетической модификации.
Описываются основные способы генетической трансформации организмов – от простейших прокариот до животных и растений. Рассматриваются пути использования генетически модифицированных организмов в биохимии, медицине, пищевой промышленности, энергетике и других направлениях деятельности человека. Подробно рассматриваются пути получения и использования иммобилизованных ферментов, уделяется внимание вопросам современной иммунобиотехнологии; клеточной инженерии, гибридомной технологии получения моноклональных антител. Рассматриваются современные прививочные препараты; иммунобиологические препараты на основе живых культур микроорганизмов.
Программа курса составлена в соответствии с Государственным образовательным стандартом Высшего профессионального образования для студентов, обучающихся по специальности020208 (012300) Биохимия.
По учебному плану этой специальности на курс биотехнология отводится 48 часов, из них 24 часа на аудиторную и 24 часов на самостоятельную работу. Из 24 часов аудиторной работы - 24 часа – лекции. По курсу предусмотрен зачет.
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ ПО СЕМЕСТРАМ И ВИДАМ УЧЕБНЫХ ЗАНЯТИЙ
N семестра |
Всего ауд. часов по плану |
Из них | Курсовые работы | Консультации | Зачет | Экзамен | Сам. работа |
|
| лекции | Лаборатор-ные занятия | |||||||
| 9 | 24 | 24 | + | + | ||||
| Итого: | 24 | 24 | + | + | ||||
СОДЕРЖАНИЕ ДИСЦИПЛИНЫ
Предмет и задачи биотехнологии
Современное состояние и перспективы развития биотехнологии, объекты и методы биотехнологии. Связь биотехнологии с биологическими, химическими, техническими и другими науками. Практические задачи биотехнологии и важнейшие исторические этапы её развития. Основные направления биотехнологии: пищевая, медицинская, сельскохозяйственная, промышленная и экологическая биотехнологии.
Основные объекты биотехнологии
Микробная, растительная и животная клетки. Строение и химический состав клеток. Основные биополимеры клеток: белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды. Органеллы клетки, их структура и функции.
Микробная биотехнология
Характеристика отдельных групп микроорганизмов. Водоросли, простейшие, грибы, бактерии, вирусы (морфология, размножение, питание, роль в природе, практическое значение).
Преимущества микроорганизмов перед другими объектами в решении современных биотехнологических задач. Промышленные, модельные и базовые микроорганизмы. Требования к продуцентам, используемым в биотехнологическом производстве.
Методы улучшения продуцентов БАВ: мутация, селекция, Уровни регуляции клеточного метаболизма и пути воздействия на него. Физиологические и генетические способы регуляции метаболизма микроорганизмов-продуцентов. Роль внешних факторов в регуляции метаболизма продуцентов.
Использование генетических методов в биотехнологии. Генетические способы улучшения продуцентов: организменный, клеточный и молекулярный уровни.
Методы культивирования микроорганизмов.
Принципиальная технологическая схема биотехнологического производства. Аппаратурное оформление процессов выращивания микроорганизмов. Типы биореакторов. Виды и состав питательных сред для выращивания микроорганизмов. Системы перемешивания и аэрации. Системы теплообмена, пеногашения и стерилизации биореакторов. Периодическое культивирование. Непрерывное культивирование. Поверхностное и глубинное культивирование. Асептика биотехнологических процессов.
Принципы масштабирования технологических процессов: лабораторные, пилотные и промышленные ферментеры и решаемые с их использованием задачи. Зависимость конструктивных особенностей биореакторов от свойств применяемого субстрата. Специализированные ферментационные технологии: аэробные, твердофазные и газофазные процессы.
Продукты первой и второй стадии ферментации. Взаимосвязь трофо- и идиофазы при получении первичных и вторичных метаболитов.
Конечные стадии получения продуктов биотехнологических процессов
Отделение биомассы: флотация, фильтрование и центрифугирование. Получение внутриклеточных и внеклеточных продуктов биосинтеза. Методы дезинтеграции клеток: физические, химические, “биологические”. Выделение целевого продукта: осаждение, экстракция, адсорбция. Электрохимические методы, хроматография, иммуноэлекторофорез, концентрирование, обезвоживание (сушка), модификация и стабилизация целевых продуктов биотехнологических процессов.
Сырьевая база биотехнологии
Критерии, определяющие выбор сырья для биотехнологических процессов. Природные сырьевые материалы растительного происхождения. Отходы различных производств как сырье для биотехнологических процессов. Химические и нефтехимические субстраты. Перспективы использования в качестве источников углерода твердых и жидких углеводородов и метана. Способы переработки сырья.
Производство микробного белка
Проблема сбалансированных кормов и питания. Продуценты белка. Требования, предъявляемые к микробному белку и возможности его использования. Сырьевая база производства белка одноклеточных организмов: высокоэнергетические субстраты, отходы сельского хозяйства и других производств. Принципиальная схема производства белка одноклеточных организмов.
Биотехнология получения первичных и вторичных метаболитов
Биотехнология получения незаменимых аминокислот. Применение незаменимых аминокислот в медицине и животноводстве. Объемы производства и перспективы. Способы промышленного получения аминокислот. Микробиологический синтез аминокислот. Технологические схемы. Одно- и двухступенчатый способы биосинтеза аминокислот.
Биотехнология получения витаминов. Значение витаминов для человека и животных. Производство каротиноидов, витамина D, рибофлавина. Производство аскорбиновой кислоты как пример химико-ферментативного процесса.
Производство органических кислот. Применение органических кислот. Производство молочной и уксусной кислот. Производство лимонной кислоты: продуценты, субстраты, поверхностный и глубинный способы ферментации, технологические схемы производства.
Производство антибиотиков. Антибиотики, их классификация, основные группы антибиотиков. Применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и консервной промышленности. Продуценты антибиотиков. Общая технологическая схема производства антибиотиков. Промышленная схема производства пенициллина.
Научные принципы обеспечения сверхпродукции. Получение ауксотрофных и регуляторных мутантов. Амплификация генов ферментов, отвечающих за синтез целевого продукта. Применение генной инженерии для получения сверхпродуцентов.
Ферментная технология
Продуценты ферментов, особенности их отбора и культивирование. Выделение и очистка ферментов. Применение ферментных препаратов в промышленности, медицине и быту.
Иммобилизованные системы в биотехнологии
Инженерная энзимология и повышение эффективности биообъектов (индивидуальных ферментов, ферментных комплексов и клеток продуцентов) в условиях производства. Иммобилизованные (на нерастворимых носителях) биообъекты и их многократное использование. Ресурсосбережение.
Экологические преимущества. Экономическая целесообразность. Повышение качества препаратов лекарственных веществ (гарантия высокой степени очистки, отсутствия пирогенных, аллергенных примесей).
Нерастворимые носители органической и неорганической природы. Микроструктура носителей.
Иммобилизация за счет образования ковалентных связей между ферментом и носителем. Предварительная активация носителя бромистым цианом. Механизм активации. Ковалентные связи с помощью бифункциональных реагентов между молекулами фермента, связанного с носителем. Влияние иммобилизации ферментов на их субстратный спектр и кинетические характеристики. Повышение стабильности. Расширение зоны оптимальной температуры. Причины указанных явлений.
Адсорбция ферментов на инертных носителях и ионообменниках. Причины частичных ограничений использования этого метода иммобилизации.
Иммобилизация ферментов путем включения в структуру геля. Органические и неорганические гели. Методы включения в альгинатный и полиакриламидный гель. Причины частичных ограничений использования метода при высокомолекулярных субстратах.
Микрокапсулирование ферментов как один из способов их иммобилизации. Размеры и состав оболочки микрокапсул.
Биокатализ в тонком органическом синтезе. Использование иммобилизованных ферментов при производстве полусинтетических бета-лактамных антибиотиков, трансформации стероидов, биокаталитическом получении простаноидов, разделении рацематов аминокислот.
Иммобилизованные ферменты и лечебное питание. Удаление лактозы из молока с помощью иммобилизованной бета-галактозидазы. Превращение глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы.
Ферментные электроды на основе иммобилизованных ферментов: глюкозооксидазы, лактатдегидрогеназы уреазы, пенициллиназы.
Иммобилизация целых клеток микроорганизмов и растений. Моноферментные биокатализаторы на основе целых клеток. Внутриклеточная регенерация коферментов. Проблемы диффузии субстрата в клетку и выхода продукта реакции. Повышение проницаемости оболочки у иммобилизуемых клеток.
Полный синтез целевого продукта иммобилизованными клетками продуцентов. Использование для иммобилизации клеток в наиболее продуктивной фазе ростового цикла. Особенности физиологии клеток, находящихся в ячейках геля. Перспективы использования "плюс" вариантов продуцентов после протопластирования и регенерации мицелия. Создание биокатализаторов второго поколения на основе одновременной иммобилизации продуцентов и ферментов трансформации продукта биосинтеза. Объединение в одном реакторе процесса биосинтеза и реакции трансформации. "Открытые системы для усложнения". Биореакторы различных типов.
Генетическая инженерия в биотехнологии
Генетическая инженерия и технология рекомбинантных молекул. Основные открытия, теоретически обосновавшие технологический подход к наследственной информации. Общие понятия о матричных процессах: репликация, транскрипция, трансляция.
Инструменты генети
Понятие вектора. Общие свойства векторов. Специализированные векторные системы. Векторные системы, применяемые при молекулярном клонировании в клетках прокариотических организмов. Типы векторов: плазмидные и фаговые векторы природного и искусственного происхождения. Принципы конструирования векторов. Фаг лямбда и векторы, сконструированные на основе его генома. Фазмиды, космиды и их применение. Упаковочная система фага лямбда. Банки генов и клонотеки. Векторы на основе генома нитевидных фагов. Особенности трансформации грамотрицательных и грамположительных бактерий. Векторы для клонирования в грамположительных бактериях. Челночные векторы.
Векторные системы для клонирования в клетках дрожжей. Использование вирусных геномов в качестве векторов для введения генетической информации в клетки животных. Природные векторы для растений. Организация и “поведение” Ti-плазмиды.
Экспрессия чужеродной генетической информации в клетках бактерий, дрожжей, растений и животных. Особенности организации векторных систем для экспрессии генов. Сложная структура организации эукариотических генов и их экспрессия в прокариотических клетках. Получение продуцента человеческого гормона роста.
Стратегия клонирования на примере введения чужеродной ДНК в E.сoliс использованием pBR322. Методы отбора клеток, наследующих рекомбинантные молекулы с необходимым геном.
Получение вакцин и иммунобиологических препаратов.
Основы иммунологии. Общие сведения об иммунитете. Формы иммунитета. Понятия об антигенах и антителах. Классификация антител. Структура антител.
Моноклональные антитела как универсальные аналитические реагенты в биохимических исследованиях. Применение моноклональных антител в медицине. Гибридомная технология получения моноклональных антител.
Современная классификация вакцинных препаратов. Технологии получения вакцин на основе живых и мертвых клеток микроорганизмов. Вирусные вакцины. Анатоксины. Технология получения анатоксинов. Сывороточные препараты. Препараты на основе живых культур микроорганизмов. Требования к штаммам, используемым дл приготовления препаратов на основе живых культур микроорганизмов. Генно-инженерные вакцины.
Клеточная инженерия
Методы культивирования клеток высших растений. Тотипотентность растительных клеток. Каллусные и суспензионные культуры; методы получения и область использования. Протопласты растительных клеток; способы получения, методы культивирования и регенерации. Слияние протопластов растительных клеток и методы реверсии. Гибридизация соматических клеток растений.
Культивирование клеток и тканей животных. Приемы культивирования в суспензионной культуре и на плотных средах. Необходимые условия для культивирования клеток животных. Конструктивные особенности биореакторов.
Использование биотехнологии для решения экологических проблем
Особенности роста и культивирования микроорганизмов в очистных сооружениях. Очистка сточных вод и отходящих газов. Переработка твердых отходов с образованием биогаза. Очистка природных сред от техногенных загрязнений.
Примерное распределение часов по темам
N п/п |
Наименование темы | Кол-во часов |
В том числе | ||
| Лекций | Практи- ческие |
Самост. | |||
| 1 | Предмет и задачи биотехнологии | 2 | 1 | 1 | |
| 2 | Экологическая биотехнология. Биологические источники энергии | 2 | 1 | 1 | |
| 3 | Методы культивирования микроорганизмов | 2 | 1 | 1 | |
| 4 | Продуценты ферментов, особенности их отбора и культивирования. Выделение и очистка ферментов. Применение микробных ферментов в пищевой промышленности и медицине | 2 | 2 | ||
| 5 | Микробиологический синтез органических кислот и аминокислот | 2 | 1 | 1 | |
| 6 | Биотехнология получения витаминов. Получение рибофлавина и витамина В 12 | 2 | 1 | 1 | |
| 7 | Антибиотики, классификация и основные стадии производства | 2 | 2 | ||
| 8 | Иммобилизованные ферменты. Методы получения и основные характеристики | 4 | 2 | 2 | |
| 9 | Применение иммобилизованных ферментов в биотехнологии | 4 | 2 | 2 | |
| 10 | Иммобилизация целых клеток и пути их использования. Биореакторы | 4 | 2 | 2 | |
| 11 | Генетические основы совершенствования биообъектов | 4 | 2 | 2 | |
| 12 | Технологии клонирования | 2 | 2 | ||
| 13 | Основные стадии метода ПЦР и сайт-специфического мутагенеза | 2 | 1 | 1 | |
| 14 | Моноклональные антитела. Гибридомная технология их получения | 2 | 1 | 1 | |
| 15 | Основы иммунологии. Производство вакцин | 2 | 2 | ||
| 16 | Агробиотехнология. Методы получения и пути использования генно-модифицированных растений | 2 | 1 | 1 | |
| 17 | Новые методы молекулярной диагностики в медицине | 4 | 2 | 2 | |
| 18 | Стволовые клетки и тканевый инженеринг | 4 | 2 | 2 | |
| Итого: | 48 | 24 | 24 | ||
ФОРМА ИТОГОВОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ – ЗАЧЕТ
ПРИМЕРНЫЙ ПЕРЕЧЕНЬ ВОПРОСОВ К ЗАЧЕТУ
1) Предмет и задачи современной биологической технологии. Объекты и методы биотехнологии
2) Основные особенности культивирования биообъектов. Питательные схемы и стадии биотехнологических процессов
3) Аппаратурное оформление процессов выращивания микроорганизмов. Типы биореакторов. Виды и состав питательных сред для выращивания микроорганизмов. Системы перемешивания и аэрации. Системы теплообмена, пеногашения и стерилизации биореакторов. Периодическое и непрерывное культивирование.
4) Выбор, селекция и хранение микроорганизмов – продуцентов ферментов. Продукты первой и второй стадии ферментации. Взаимосвязь трофо- и идиофазы при получении первичных и вторичных метаболитов
5) Поверхностный способ выращивания микроорганизмов. Питательные среды, продуценты и основные стадии процесса
6) Глубинный метод выращивания микроорганизмов. Питательные среды, продуценты и основные стадии процесса
7) Сравнительная характеристика поверхностного и глубинного способов выращивания микроорганизмов.
8) Методы выделения и очистки в биотехнологии. Получение внутриклеточных и внеклеточных продуктов биосинтеза. Дезинтеграция клеток, осаждение, экстракция, адсорбция, электрохимические методы, хроматография, иммуноэлекторофорез, концентрирование, обезвоживание (сушка), модификация и стабилизация целевых продуктов биотехнологических процессов.
9) Применение амилолитических и протеолитических ферментов в пищевой промышленности и в медицине
10) Производство микробного белка. Продуценты белка. Требования, предъявляемые к микробному белку и возможности его использования. Принципиальная схема производства белка одноклеточных организмов.
11) Способы промышленного получения аминокислот. Микробиологический синтез аминокислот – получение лизина и триптофана. Применение незаменимых аминокислот в медицине и животноводстве.
12) Антибиотики, их классификация, основные группы антибиотиков. Применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и консервной промышленности. Продуценты антибиотиков. Общая технологическая схема производства антибиотиков. Промышленная схема производства пенициллина.
13) Продуценты ферментов, особенности их отбора и культивирование. Выделение и очистка ферментов. Применение ферментных препаратов в промышленности, медицине и быту.
14) Иммобилизованные ферменты и преимущества их применения в биотехнологии. Носители, используемые для иммобилизации ферментов, химические и физические методы иммобилизации ферментов.
15) Сравнительная характеристика свободных и иммобилизованных ферментов. Применение иммобилизованных ферментов в тонком органическом синтезе. Использование иммобилизованных ферментов при производстве полусинтетических бета-лактамных антибиотиков, трансформации стероидов, биокаталитическом получении простаноидов, разделении рацематов аминокислот.
16) Иммобилизованные ферменты и лечебное питание. Удаление лактозы из молока с помощью иммобилизованной бета-галактозидазы. Превращение глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы.
17) Иммобилизация целых клеток микроорганизмов и растений. Моноферментные биокатализаторы на основе целых клеток. Внутриклеточная регенерация коферментов. Проблемы диффузии субстрата в клетку и выхода продукта реакции. Повышение проницаемости оболочки у иммобилизуемых клеток. Биокатализаторы второго поколения.
18) Биотехнология получения витаминов. Значение витаминов для человека и животных. Получение рибофлавина. Производство витамина В 12 как пример безотходной и экологически чистой технологии.
19) Получение органических кислот микробиологическими методами. Производство лимонной кислоты
20) Получение органических кислот микробиологическими методами. Производство молочной кислоты
21) Получение органических кислот микробиологическими методами. Производство уксусной кислоты
22) Генетическая инженерия в биотехнологии. Общие понятия о матричных процессах: репликация, транскрипция, трансляция. Рестрицирующие эндонуклеазы, векторы и клетки-хозяева как инструменты генетической инженерии.
23) Стратегия клонирования на примере введения чужеродной ДНК в E.сoliс использованием pBR322. Методы отбора клеток, наследующих рекомбинантные молекулы с необходимым геном.
24) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) как метод амплификации ДНК. Реагенты и основные стадии процесса. Возможности использования ПЦР в медицине и научных исследованиях.
25) Сайт-специфический мутагенез как метод направленной модификации белка. Основные стадии процесса.
26) Основы иммунологии. Общие сведения об иммунитете. Формы иммунитета. Понятия об антигенах и антителах. Классификация антител. Структура антител, строение и роль константных и вариабельных областей иммуноглобулинов.
27) Гибридомная технология получения моноклональных антител. Моноклональные антитела как универсальные аналитические реагенты в биохимических исследованиях. Общие представления об иммуноферментном анализе. Применение моноклональных антител в медицине.
28) Методы культивирования клеток высших растений. Тотипотентность растительных клеток. Каллусные и суспензионные культуры; методы получения и область использования. Фитобиотехнология.
29) Культивирование клеток и тканей животных. Зообиотехнология. Приемы культивирования в суспензионной культуре и на плотных средах. Необходимые условия для культивирования клеток животных. Конструктивные особенности биореакторов.
30) Биология эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Получение иммуносовместимых тканей методом переноса ядра из соматических клеток.
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ДИСЦИПЛИНЫ
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Беккер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990.
2. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: Наука, 1995.
3. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М: Мир. 1987.
4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. – М.: Мир, 2002.
5. Промышленная микробиология./ Под ред. Егорова Н.С. — М.: "Высшая школа", 1989. 6. Биотехнология в 8-ми томах. Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. – М.: Высшая школа, 1987-1988.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Шлегель Г. Общая микробиология. — М.: Мир, 1987.
2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки (в 3 т.). – М. Мир, 1994
3. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. — М.: Изд-во МГУ, 1985.
4. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology // Ed. In chief A.L. Demain, J.E. Davies . – ASM. Washington, DC, 1999.
5. Красноштанова А.А., Крылов И.А., Бабусенко Е.С. – Основы биотехнологии. – М., РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2000.
Учебная рабочая программа по дисциплине «Биотехнология» для специальности 020208 (012300) – «Биохимия» обсуждена и одобрена на заседании кафедры биохимии
Протокол №______ от «_____»___________ 2006 года
Зав. кафедрой биохимии
д.б.н., профессор _________________________________ М.Т. Генгин
(подпись)
Одобрено методическим советом Естественно-географического факультета
Протокол №______ от «_____»___________ 2006 года
Председатель Методического совета
Естественно-географического факультета,
к.т.н., доцент ___________________________ О.В. Зорькина
(подпись)
Составитель:
Канд. хим. наук, доцент Кузнецова А. В. _________________________
(подпись)