Иммуноферментный анализ с усиленной хемилюминесценцией
ВВЕДЕНИЕ
Определять ферментную метку количественно можно различными методами, например, с помощью колориметрии, флуориметрии, радиометрии и потенциометрии. Недавно для этой цели стали применять также хемилюминесценцию или биолюминесценцию. Ферментные метки, которые можно определять с помощью реакций, сопровождающихся излучением света, представлены в табл. 1. В общем случае чувствительность хеми- и биолюминесцентных методов определения очень высока, а если использовать еще и усиление сигнала от ферментной метки, то чувствительность соответствующих методик иммуноанализа должна быть чрезвычайно высокой. Возможности биолюминесцентного метода недавно были продемонстрированы на примере определения Д-галак-тозидазы. С помощью сопряженной реакции галактозо-дегидроге-наза АОН:РМ№оксидоредуктаза-бактериальная люцифераза удалось обнаружить 2 • 10"22
моля /3-галактозидазы.
В качестве метки в иммуноферментном анализе широко применяют пероксидазу хрена, методы получения и стабилизации конъюгатов с которой хорошо изучены. Пероксидазу хрена чаще всего определяют колориметрически, но для этой цели можно также использовать различные хеми- и биолюминесцентные реакции.
Детально изучено определение пероксидазы с помощью хеми-люминесцентной реакции в системе люминол - пероксид водорода, усиленной фенольными соединениями. Такой подход к определению активности фермента имеет ряд преимуществ в сравнении с другими методами определения; его основные характеристики перечислены в табл. 2.
Усилители. Способностью усиливать излучение света в реакции окисления люминала пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой, обладают различные соединения, в том числе 6-гидроксибензотиазолы, например люциферин, фенолы, нафтолы и амины. На рис. 1 изображены структуры представителей веществ каждого класса. Степень усиления излучения света зависит от концентрации реагентов. Типичная зависимость интенсивности свечения от концентрации усилителя в реакции люмино-ла с пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой и усиливаемой 6-гидрокси-бензотиазолом, представлена на рис. 2.
Синергизм и степень усиления. В системе перокси-даза - люминал - пероксид водорода наблюдается эффект сине-
ргизма, о чем свидетельствуют данные, приведенные в табл. 3. На степень усиления влияют многие факторы; тем не менее достигнуто усиление излучения света более чем в 500 раз. В присутствии некоторых усилителей фоновое излучение света в системе люминол - пероксид водорода уменьшается. При определении активности пероксидазы это позволяет на несколько порядков повысить отношение сигнала к шуму только, за счет применения таких усилителей.
Усиление свечения характерно для различных циклических диацилгидразидов, при действии окислителей в присутствии пероксндазы. Усиление не наблюдается в случае некоторых веществ с пероксидазной активностью, например гемоглобина, который катализирует только колориметрические реакции. Этот факт свидетельствует о более высокой специфичности усиленного хемилюминесцентного анализа по сравнению с колориметрическими методами. Спектры излучаемого света практически одинаковы в усиленных и неусиленных реакциях. Это "говорит о том, что сам по себе усилитель не излучает свет.
В отсутствие усилителей хемилюминесценция в системе пе-роксидаза-люминол-пероксид, по-видимому, лимитируется относительно медленной реакцией пероксндазы, находящейся в форме так называемого соединения II, с люминолом, в результате которой образуются люминольные радикалы и регенерируется пероксидаза. Усилители, способные быстро реагировать с таким соединением, могут увеличивать излучение света, ускоряя превращение соединения II в активную пероксидазу. Продукты превращения усилителя могут затем быстро реагировать с люминолом, образуя дополнительные люминольные радикалы и тем самым способствуя дальнейшему усилению излучения света. Усилители могут воздействовать и на неактивные перокс
Реагенты
Важным фактором в определении пероксидазной активности с помощью усиленной хемилюминесценции является химическая чистота циклических диацилгидразидов. Изучение различных образцов люминола показало, что примеси отрицательно влияют на излучение света. В результате фотохимических и термических процессов люминол частично разлагается, а образующиеся примеси влияют на кинетику и интенсивность излучения света. В табл. 4 представлены результаты сравнения чистоты и свойств некоторых поступающих в продажу препаратов люминола, а также натриевой соли люминола, очищенной перекристаллизацией из раствора гидроксида натрия.
2. УСИЛЕННЫЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ
Усиленный хемилюминесцентный иммуноанализ с пероксидазой в качестве ферментной метки применяли для определения многих соединений. Ряд примеров приведен в табл. 5. В этих иммуноанализах применяли конкурентные методы и методы с экстракцией иммунного комплекса, а также большинство обычно используемых твердых носителей. На
а
Отношение сигнал/фон при хемилюминесцентном определении пероксидазы хрена с усилением л-иодфенолом; 6
ТСХ - тонкослойная хроматография.
рис. 3 представлена схема определения фолликулстимулирующего гормона. В этом методе предел обнаружения FSH на микротитровальном планшете равен около 0,01 м.ед. Метод характеризуется отличной воспроизводимостью как в одном анализе, так и между анализами.
Метод усиленной хемилюминесценции успешно применялся также для обнаружения пероксидазной метки при изучении гибридизации ДНК. Описан
метод количественного определения с использованием фотометра для планшетов и качественного анализа с применением фотографического обнаружения с чувствительностью несколько пикограмм.
Приборы
В настоящее время промышленность выпускает несколько типов люминометров, пригодных для измерения света, излучаемого в реакциях усиленной хемилюминесценции. Некоторые из этих люминометров были модернизированы специально для усиленного хемилюминесцентного анализа. Интенсивность и продолжительность излучения света в реакциях с усилением люминесценции облегчили создание простых люминометров, в которых в качестве детекторов используются кремниевые' фотодиоды или высокочувствительная фотографическая пленка. Такие люминометры относительно недороги, портативны, и поэтому их можно применять и вне лабораторий. В настоящее время фирма MASTImmunosystems выпускает специальные фотокамеры для хемилюминесцентной детекции в методе ИФА аллергенспецифического иммуноглобулина Е. Можно предположить, что в будущем будут созданы наборы с фотографической регистрацией результатов ИФА и других соединений, определение которых необходимо проводить в клиниках, больницах или на дому.
Выпускаемые приборы и наборы реагентов.
Наборы для усиленного хемилюминесцентного иммуноферментного анализа и соответствующие приборы сейчас выпускаются под названием Amerlite фирмой AmershamInternationalpic.
Анализ выполняется на стрипах микротитровальных планшетов белого цвета, а измерение люминесценции быстро и автоматически выполняет специальный люминометр для микропланшетов. В настоящее время выпускаются наборы для определения тироидстимулирующего гормона, хориогонадотропина человека, карциноэмбрионального антигена, альфа-фетопротеина, тироксина, трииодтиронина и для определения индекса свободного тироксина. Эти анализы имеют высокую чувст витальность и прекрасную воспроизводимость.
ВЫВОДЫ
Определение пероксидазной метки с помощью усиленной хемилюминесценции отличается высокой чувствительностью, специфичностью и простотой и может быть положено в основу при разработке удобных и быстрых методов иммуноферментного анализа, выполняемых с помощью недорогих портативных приборов.