Изучение противогипоксической активности исследуемых соединений и их эффективности в условиях экспериментальных цереброваскулярных расстройств
Введение
В патогенезе органических повреждений головного мозга ведущее значение принадлежит циркуляторным расстройствам. При ишемии головного мозга вследствие уменьшения кровотока ограничивается поступление в ткань кислорода. Происходит нарушение дыхательной цепи митохондрий с повышением уровня восстановленности её компонентов. При этом резко возрастает поток свободных электронов, приводящий к образованию АКФ. В дальнейшем при углублении ишемии нарушаются все жизненно важные функции клетки, усиливаются процессы свободнорадикального окисления, развивается состояние «оксидантного стресса».
Представляло интерес изучить влияние исследуемых соединений на выживаемость животных в условиях нормобарической гипоксии с гиперкапнией, а также на устойчивость белых крыс к циркуляторной гипоксии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий и критическими гравитационными перегрузками.
Учитывая наличие выраженного антиоксидантного действия у селенитов следующим этапом нашего исследования было изучение влияния исследуемых соединений на динамику развития постишемических цереброваскулярных феноменов.
1. Влияние селенита натрия и селенита цинка на устойчивость животных к гипоксической гипоксии
Эксперименты проведены на 70 белых беспородных мышах обоего пола массой 23 - 25 г, выращенных в стандартных условиях вивария. Критерием эффективности антигипоксического действия была продолжительность жизни животных. Исследуемые вещества вводили однократно внутрибрюшинно за 10 – 15 минут до начала эксперимента в дозах 30, 50 и 100 мкг/кг. Контролем служил физиологический раствор, вводимый в эквивалентном объеме. Статистика проводилась с помощью «критерия ранговых знаков Уилкоксона» и подтверждена статистикой «критерием знаков» (таблица 19).
Таблица 19 - Влияние селенита натрия и селенита цинка на продолжительность жизни мышей в условиях нормобарической гипоксии (M±m,
D%)
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг |
Кол-во животных |
Среднее время жизни | |
| минуты | D% от контроля | |||
| Физ. раствор | 10 | 57,0±9,0 | --- | |
| Селенит натрия | 30 | 10 | 69,5±22,3* | +21,9%* |
| 50 | 10 | 64,5±8,5** | +13,2%** | |
| 100 | 10 | 58,5±7,5 | +2,6% | |
| Селенит цинка | 30 | 10 | 81,5±24,8* | +43,0%** |
| 50 | 10 | 67,5±17,0* | +18,4%* | |
| 100 | 10 | 59,0±8,8 | +3,5% | |
Примечание
1 * - достоверно относительно физ. раствора; р≤0,05
2 ** - достоверно относительно физ. раствора; р≤0,01
Полученные результаты исследований позволяют утверждать, что селенит натрия и селенит цинка достоверно увеличивают продолжительность жизни животных в условиях нормобарической гипоксии в сравнении с контролем в дозах 30 мкг/кг и 50мкг/кг. Так, при предварительном введении селенита натрия в дозе 30 мкг/кг средняя продолжительность жизни мышей увеличилась на 21,9% по отношению к контролю. В дозе 50 мкг/кг время жизни возросло на 13,2%.При введении селенита натрия в дозе 100 мкг/кг продолжительность жизни белых мышей достоверно не изменялась по сравнению с животным контрольной группы. Более выраженный антигипоксический эффект оказывал селенит цинка. Введение селенита цинка в дозе 30 мкг/кг увеличивало продолжительность жизни животных на 43%. С увеличением дозы антигипоксический эффект селенита цинка уменьшался. Продолжительность жизни белых мышей увеличивалась на 18, 4% при введении селенита цинка в дозе 50 мкг/кг и практически не изменялась при его введении в дозе 100 мкг/кг (рисунок 4).
Примечание:
1 * - достоверно относительно физ. раствора; р≤0,05
2 ** - достоверно относительно физ. раствора; р≤0,01
Рисунок 4 - Влияние селенита натрия и селенита цинка на продолжительность жизни мышей в условиях нормобарической гипоксии, в процентном отношении к контролю (M±m, D%)
Таким образом, было установлено, что селенит натрия и селенит цинка увеличивают время жизни животных при введении в дозах 50 мкг/кг и 30 мкг/кг.
2. Влияние селенита натрия и селенита цинка на устойчивость животных к циркуляторной гипоксии мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий
Эксперименты проведены на 24 белых беспородных крысах, обоего пола, массой 220-250 г, выращенных в стандартных условиях вивария. Критерием эффективности антигипоксического действия была выживаемость животных в течение 72 часов после двусторонней окклюзии сонных артерий. Исследуемые вещества вводили однократно внутрибрюшинно за 10–15 минут до начала эксперимента в дозах 30, 50 и 100 мкг/кг. Контролем служил физиологический раствор в эквивалентном объеме.
Результаты контрольной серии опытов показали, что большинство животных погибло в течение первых суток. Через 72 часа после операции в контрольной группе число выживших животных составило 25%. Нами установлено, что исследуемые соединения обладают антигипоксической активностью.
При профилактическом введении селенита натрия в дозе 30 мкг/кг за 15 минут до ишемии выживаемость животных несколько повысилась. Через 48 часов выживаемость оказалась равной 50%. Введение селенита натрия в дозе 50 мкг/кг вызывало наиболее выраженный антигипоксический эффект. Выживаемость животных на 2-3 сутки составила 62,5%. При увеличении дозы селенита натрия до 100 мкг/кг антигипоксический эффект был равен эффекту при введении соединения в дозе 30 мкг/кг. В опытах с предварительным введением селенита цинка в дозе 30 мкг/кг через 72 часа наблюдения выжило 4 крысы из 8 и выживаемость составила 62,5%. Одинаковый антигипоксический эффект наблюдался при введении селенита цинка в дозах 50 и 100 мкг/кг. Выживаемость животных к концу наблюдения составила 62,5%. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что селенит натрия и селенит цинка обладают антигипоксической активностью, увеличивают процент выживаемости животных при циркуляторной гипоксии, особенно эффективным оказалось введение селенита натрия в дозе 50 мкг/кг. Селенит цинка был активен при его введении в дозах 50 и 100 мкг/кг. Результаты экспериментов представлены в таблице 20 и на рисунке 5.
Таблица 20 - Влияние селенита натрия и селенита цинка на устойчивость белых крыс к циркуляторной гипоксии (M±m,
D%)
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг |
Кол-во животных |
Кол-во выживших животных | |||||
Через 24 часа |
Через 48 часа |
Через 72 часа |
||||||
| Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | |||
| Физ. раствор | 8 | 5 | 62,5 | 3 | 37,5 | 2 | 25 | |
| Селенит натрия | 30 | 8 | 5 | 62,5 | 4 | 50 | 4 | 50 |
| 50 | 8 | 6 | 75 | 5 | 62,5* | 5 | 62,5* | |
| 100 | 8 | 5 | 62,5 | 4 | 50 | 4 | 50 | |
| Селенит цинка | 30 | 8 | 5 | 62,5 | 5 | 62,5 | 4 | 50 |
| 50 | 8 | 6 | 75 | 6 | 75 | 5 | 62,5* | |
| 100 | 8 | 6 | 75 | 5 | 62,5* | 5 | 62,5* | |
Примечание - достоверно относительно физ. раствора; * - р ≤ 0,05
Примечание - достоверно относительно физ. раствора; * - р≤0,05
По оси абсцисс – время эксперимента; по оси ординат – выживаемость белых крыс в процентах от исходного уровня
Рисунок 5 - Влияние селенита натрия и селенита цинка на выживаемость белых крыс при циркуляторной гипоксии (M±m, D%)
3. Влияние селенита натрия и селенита цинка на устойчивость животных к тотальной ишемии мозга, вызванной критическими гравитационными перегрузками
Учитывая антигипоксическую активность исследуемых соединений при циркуляторной гипоксии мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий представляло интерес изучить их действие на устойчивость организма белых крыс к критическим гравитационным перегрузкам.
Известно, что продольные гравитационные перегрузки, создаваемые центрифугой, вызывают нарушения кровоснабжения головного мозга. При краниокаудальном векторе ускорения (положительные радиальные ускорения) происходит перемещение крови в каудальном направлении, в результате чего давление в сосудах мозга снижается и возникает его ишемия, уже при перегрузке 4-5g, давление в сонных артериях снижается до нулевого уровня. Степень проявления цереброваскулярных нарушений зависит от величины и продолжительности перегрузки, а также от градиента её нарастания и спада, что позволяет их дозировать.
Исследования проведены на белых крысах одного возраста и примерно одной массы 220-250 г. Белые крысы являются наиболее пригодным объектом для таких исследований, поскольку у них отмечается довольно чёткая зависимость между выживаемостью и величиной перегрузок.
Животных помещали в отдельные продольные ячейки, объём ячеек соответствовал размеру животных и не давал возможности самопроизвольно отклоняться от заданного вектора ускорения. В эксперименте было использовано 36 белых крыс, по 12 в контроле и в опытах с профилактическим введением селенита натрия и селенита цинка. Исследуемые вещества вводились внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг за 10-15 минут до перегрузок. Исследование устойчивости животных к гравитационным перегрузкам проводили при кранио-каудальном векторе ускорения.
Центрифугирование животных проводили в 2 этапа. На первом этапе исследования крысы подвергались воздействию перегрузок величиной 16 g в течение 10 минут, после чего центрифугу останавливали на 5 минут. На втором этапе исследований, по истечении 5 минутного перерыва, животные подвергались перегрузкам величиной 21 g в течение 5 минут.
В результате исследований было установлено, что большинство животных погибло на втором этапе исследований. Так, в контрольной группе на первой стадии эксперимента погибли 2 крысы из 12, что составило 16,7%, при повторном центрифугировании погибли 3 крысы, что составило 41,7%. При профилактическом введении селенита натрия на первой стадии эксперимента из 12 крыс погибла 1, что составило 8,3 %, на втором этапе погибли 2 крысы, что составило 25%.
Селенит цинка проявлял более выраженный защитный эффект: на первой стадии эксперимента не погибло ни одного животного. Выживаемость крыс составила 100%. На втором этапе исследований погибла 1 крыса из 12, что составило 8,3%. Результаты проведённых исследований статистически обработаны и приведены на рисунке 6 и в таблице 21.
Примечание - достоверно относительно физ. раствора, * - р≤0,05
По оси абсцисс – стадия эксперимента; по оси ординат – выживаемость белых крыс в процентах от исходного уровня
Рисунок 6 – Влияние селенита натрия и селенита цинка на устойчивость белых крыс к гравитационным перегрузкам в краниокаудальном направлении
Таблица 21 – Влияние селенита натрия и селенита цинка (100 мкг/кг, внутрибрюшинно) на устойчивость белых крыс к гравитационным перегрузкам в краниокаудальном направлении
| Вещество | 1 стадия | 2 стадия | ||
Количество выживших животных |
% выживших животных |
Количество выживших животных |
% выживших животных |
|
| Контроль | 10 | 83,3% | 7 | 58,3% |
| Селенит натрия | 11 | 91,7% | 9 | 75,0% |
| Селенит цинка | 12 | 100,0% | 11* | 91,7% |
Примечание - достоверно относ
Таким образом, в результате проведённых исследований было установлено, что селенит натрия и селенит цинка в дозе 100 мкг/кг значительно увеличивают устойчивость животных к гравитационным перегрузкам в краниокаудальном направлении.
4. Влияние исследуемых соединений на мозговой кровоток у наркотизированных белых крыс в условиях глобальной ишемии мозга
Эксперименты проведены на белых беспородных крысах обоего пола, наркотизированных хлоралгидратом (300 мг/кг). Ишемию мозга моделировали двухсторонней окклюзией сонных артерий при САД равном 40 мм рт.ст. в течение 10-12 мин.
После ишемии и реинфузии крови в артериальную систему животного осуществляли регистрацию скорости МК методом клиренса водорода на фоне снижения артериального давления. Исследуемые соединения вводились в дозе 100 мкг/кг, внутрибрюшинно.
В контрольных опытах исходное значения МК составляло 101,4 ± 8,4 мл/100г/мин. В течение 15-20 мин после ишемии мозга наблюдалось увеличение МК. На 5 минуте МК достоверно был выше исходного уровня в среднем на 27,8%. К 20 минуте МК восстанавливался и в дальнейшем отмечалось его снижение. На 30 минуте степень снижения МК составила 12,7%, а к концу наблюдения (через 60 мин.) – 37,0%. Таким образом в условиях глобальной ишемии мозга ярко проявляются постишемические цереброваскулярные феномены: фаза реактивной гиперперфузии и фаза гипоперфузии (отсроченного невосстановления кровотока).
Предварительное введение (за 15 мин до ишемии) селенита натрия в дозе 100 мкг/кг вызывало изменение динамики развития цереброваскулярных феноменов в постишемическом периоде (таблица 22 - 24, рисунок 7). Первая фаза становится менее продолжительной и МК увеличивается в меньшей степени. Через 5 минут после ишемии на фоне селенита натрия МК был выше исходного уровня на 8,8%, а в контрольных опытах на 27,8%. Начиная с 15 минуты и по 60 минуту наблюдения отмечалось снижение МК. Однако степень снижения МК на 60 минуте была значительно ниже, чем в контроле.
Результаты исследования с предварительным введением селенита цинка в дозе 100 мкг/кг и последующей ишемией мозга (7 опытов) показали, что в постишемическом периоде фаза гиперперфузии была менее выражена. Так, через 5 минут после ишемии МК был выше исходного уровня на 2,4% (в контроле – 27,8%). Селенит цинка ослаблял фазу гипоперфузии головного мозга. Если в контроле на 60 минуте постишемического периода МК снижался на 37,0%, то под влиянием предварительного введения селенита цинка МК снижался на 19,1%. Таким образом профилактическое введение селенита натрия и селенита цинка существенно изменяет динамику развития постишемических цереброваскулярных феноменов. Приведённые данные о благоприятном влиянии исследуемых соединений на МК в условиях ишемии мозга позволяют в какой-то мере объяснить их защитное действие при циркуляторной гипоксии, вызванной двухсторонней перевязкой общих сонных артерий и критическими гравитационными перегрузками.
Таблица 22 – Динамика изменения мозгового кровотока в постишемическом периоде в контрольных опытах
| Исходные данные | МК
мл/100г/мин 101,4 ± 8,4 |
| Время после введения физиологического раствора | % от исходных данных |
| Через 5 мин | +27,8 ± 5,1* |
| 15 мин | +3,2 ± 4,6 |
| 30 мин | -12,7 ± 2,1* |
| 45 мин | -20,0 ± 2,5 |
| 60 мин | -37,0 ± 1,9* |
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
Таблица 23 – Влияние селенита натрия (100 мкг/кг) на мозговой кровоток белых крыс в постишемическом периоде, (M±m, n=7, D%)
| Исходные данные | МК
мл/100г/мин 81,8±27,8 |
| Время после введения селенита натрия | % от исходных данных |
| Через 5 мин | +8,8±29,8* |
| 15 мин | -20,7±30,4* |
| 30 мин | -26,9±41,3* |
| 45 мин | -23,1±30,3* |
| 60 мин | -28,3±41,3* |
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
Таблица 24 – Влияние селенита цинка (100 мкг/кг) на мозговой кровоток белых крыс в постишемическом периоде, (M±m, n=7, D%)
| Исходные данные | МК
мл/100г/мин 61,6±19,2 |
| Время после введения селенита цинка | % от исходных данных |
| Через 5 мин | +2,4±57,1* |
| 15 мин | +7,2±54,8* |
| 30 мин | -31,8±32,6* |
| 45 мин | -22,6±26,4* |
| 60 мин | -19,1±24,9* |
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
По оси абсцисс – время наблюдения в минутах; по оси ординат – изменение мозгового кровотока в процентах от исходного уровня
Рисунок 7 – Влияние селенита натрия и селенита цинка на динамику развития постишемических цереброваскулярных феноменов
5. Влияние селенита натрия и селенита цинка на артериальное давление и сопротивление мозговых сосудов в условиях экспериментальной патологии
Измерение артериального давления у животных проводили с помощью ртутного манометра, соединенного с катетером, предварительно имплантированным в сонную артерию. Для предотвращения свёртывания крови катетер заполняли раствором гепарина. Сопротивление сосудов мозга рассчитывали исходя из данных АД и МК у ишемизированных животных.
Артериальное давление как в контрольной серии экспериментов, так и в группе опытов с предварительным введением исследуемых соединений снижалось с первых минут наблюдения. В контрольной серии снижение АД было значительно меньше и к концу наблюдения составило 5,2%. В группе с предварительным введением селенита натрия (до ишемии мозга) к 60 минуте наблюдения АД снизилось на 19,6%. В опытах с предварительным введением селенита цинка снижение АД было менее выраженным и составило 14,8% к концу наблюдения.
При расчёте ССМ было отмечено, что внутрибрюшинное введение исследуемых соединений оказывало достоверное влияние на сопротивление мозговых сосудов в постишемическом периоде. На протяжении первых 10-15 минут после ишемии отмечалось достоверное снижение сопротивления мозговых сосудов с наиболее выраженным эффектом на 5 минуте на фоне селенита натрия и на 15 минуте - на фоне селенита цинка. К 30 минуте эксперимента ССМ начинало возрастать и на 60 минуте наблюдения было на 12,2% выше исходного уровня при предварительном введении селенита натрия. В меньшей степени к концу наблюдения увеличивалось ССМ. В опытах с предварительным введением селенита цинка степень увеличения ССМ была значительно ниже, чем в контроле (+5,6% и +41,1%, соответственно). Результаты проведённых исследований статистически обработаны и приведены в таблицах 25 - 27 и на рисунке 8.
Таблица 25 – Динамика изменения АД и ССМ у белых крыс в контрольной серии опытов в постишемическом периоде
| Исходные данные | АД
мм рт. ст. |
ССМ
мм рт. ст./мл/100г/мин |
| 122,6 ± 3,9 | 1,24 ± 4,0 | |
| Время после введения физиологического раствора | % от исходных данных | |
| Через 5 мин | -1,1±1,0 | -23,2 ± 4,0* |
| 15 мин | -2,9±1,1* | -3,7 ± 6,0 |
| 30 мин | -7,2 ±2,2* | +5,6 ± 4,6 |
| 45 мин | -6,1±2,4 | +23 ± 5,7 |
| 60 мин | -5,2 ±2,2* | +41,1 ± 9,9* |
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
Таблица 26 - Динамика изменения АД и ССМ у белых крыс в постишемическом периоде получавших селенит натрия в дозе 100 мкг/кг перед ишемией мозга (M±m, n=7, D%)
| Исходные данные | АД 75,3±8,3 |
|
| Время после введения селенита натрия | % от исходных данных | |
| АД | ССМ | |
| Через 5 мин | -3,8±10,3 | -5,7*±31,9 |
| 15 мин | -9,8*±13,5 | -15,5*±15,8 |
| 30 мин | -9,8*±12,6 | +32,7*±24,5 |
| 45 мин | -17,3*±18,4 | +7,2*±24,3 |
| 60 мин | -14,8*±14,2 | +5,6*±23,3 |
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
Таблица 27 - Динамика изменения АД и ССМ в постишемическом периоде у белых крыс, получавших селенит цинка в дозе 100 мкг/кг перед ишемией мозга (M±m, n=7, D%)
| Исходные данные (мл/100г/мин) | АД 76,0±10,0 |
|
| Время после введения селенита цинка | % от исходных данных | |
| АД | ССМ | |
| Через 5 мин | -8,4*±9,5 | -15,8*±43,1 |
| 15 мин | -7,8*±10,8 | +16,4*±39,8 |
| 30 мин | -12,0*±13,3 | +20,5*±31,2 |
| 45 мин | -16,9*±11,5 | +8,2*±41,8 |
| 60 мин | -19,6*±9,1 | +12,2*±33,8 |
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05
По оси абсцисс – время наблюдения в минутах; по оси ординат – изменение ССМ в процентах от исходного уровня
Рисунок 8 - Динамика изменения ССМ в постишемическом периоде у белых крыс получавших селенит натрия и селенит цинка перед ишемией мозга
Выводы
1. Селенит натрия и селенит цинка в дозах 30 и 50 мкг/кг достоверно увеличивают продолжительность жизни животных в условиях нормобарической гипоксии с гиперкапнией.
2. Селенит натрия и селенит цинка увеличивали выживаемость животных в условиях циркуляторной гипоксии мозга в сравнении с контролем.
3. Селенит натрия и селенит цинка в дозе 100 мкг/кг значительно увеличивают устойчивость животных к тотальной ишемии мозга, вызванной критическими гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении.
4. В условиях экспериментальной ишемии мозга исследуемые соединения при их профилактическом введении существенно изменяют динамику развития постишемических цереброваскулярных феноменов, уменьшают степень проявления реактивной гиперемии и тормозят развитие фазы невосстановления мозгового кровотока.
5. Общая гипотензия, характерная для постишемического периода несколько усиливалась при предварительном введении селенита натрия и селенита цинка. Расчёт ССМ показал, что при введении селенита натрия к 60 минуте наблюдения оно было примерно в 2 раза ниже, чем в контрольной серии опытов, а при введении селенита цинка к концу эксперимента ССМ было близко к исходному.
Содержание
1. Скворцова, В.И. Лечение и профилактика ишемического инсульта / Скорцова В.И., Стаховская Л.В. // Диагностика и терапия в клинике внутренних болезней: лекции для практикующих врачей, 10 Рос. нац. конгр. – М., 2004. - С. 142-160.
2. Кузнецов, Г.П. Клиническое значение селенодефецита у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями самарского региона и его коррекции препаратом «Cелена» / Г.П. Кузнецов, П.Л. Лебедев // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2005. - Т.58, №5. – С. 26-28.
3. Демченко, И.Т. Кровоснабжение бодрствующего мозга / И.Т. Демченко. – Л.: Наука, 2007. – 174 с.
4. Физиология ЦНС: Учеб. пособие. – Ростов н/Д: Феникс, 2007. - 450 с.
5. Балуева, Т.В. К вопросу о центральной норадренергической регуляции мозгового кровообращения / Т.В. Балуева // Физиол. журн. СССР им. Сеченова. – 2006. - №7. - С. 913-917.
6. Анатомия человека: В 2 т. / Под ред. М.Р. Сапина. - М.: Медицина, 2007. - Т.2. - 479 с.