ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВНАНИЯ
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
Ветеринарно-санитарный факультет
Кафедра микробиологии и иммунологии
КУРСОВАЯ РАБОТА
по санитарной микробиологии
на тему: «Clostridium botulinum – возбудитель пищевых токсикозов»
Выполнила:
студентка 4 курса 8 группы
ветеринарно-санитарного факультета
Косачёва О. В.
Проверила:
Корнелаева Р. П.
Москва 2009
ПЛАН
стр.
1. История изучения………………………………………..4
2. Морфология и культуральные свойства……………….5
3. Биохимические свойства……………………………….6
4. Токсинообразование……………………………………7
5. Антигенный состав…………………………………….8
6. Устойчивость…………………………………………..9
7. Восприимчивость человека и животных……………12
8. Болезнетворность (патогенность)…………………...13
9. Диагностика…………………………………………..15
10. Профилактика……………………………………….16
11. Оценка мяса………………………………………….17
12. Список литературы………………………………….18
Clostridium botulinum — грамположительная бактерия рода клостридий, возбудитель ботулизма — тяжёлой пищевой интоксикации, вызываемой ботулиническим токсином и характеризуемой поражением нервной системы.
|
Clostridium botulinum
|
||||||||||||||
| Научная классификация
|
||||||||||||||
|
ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ
Впервые эти бактерии выявил в 1895 году бельгийский микробиолог Эмиль Пьер ван Эрменгем (Emile Pierre van Ermengem), ученик Роберта Коха. Однако, первые упоминания о вызываемом ими ботулизме относятся еще к 1793 году, когда в Германии после употребления в пищу копченой кровяной колбасы заболели 13 человек, 6 из которых скончались. Аналогичные пищевые отравления колбасой с гибелью большого числа людей наблюдались в Германии во время войны с Наполеоном в 1795—1813 годах. Тогда считалось, что эта смертность связана с отсутствием гигиены питания в деревнях в связи с войной.
Первым учёным, который занялся сбором статистики по случаям подобных отравлений и их симптомов, был профессор медицины Heinrich Ferdinand Autenreith из Тюбингенского университета. Опубликованный им в газете в 1817 году список симптомов включал желудочно-кишечные нарушения, двоение в глазах и расширение зрачка. Также Autenreith обнаружил связь между силой действия яда и степенью прожарки колбасы.
Одним из медиков, представивших профессору описания случаев отравления, был санитарный врач Justinus Kerner. В дальнейшем Kerner значительную часть своей жизни посвятил изучению ботулинического токсина, и считается крестным отцом его исследований. Проводя испытания на животных и на самом себе, он пытался выделить из колбасы неизвестный токсин, который сам называл «колбасный яд», «жирный яд» или «жировая кислота». Результаты этих исследований были опубликованы им в 1822 году в монографии, описывавшей 155 случаев отравления у человека и эксперименты на животных, в соответствии с которыми делался вывод о том, что действие токсина заключается в нарушении передачи импульса в волокнах периферической и автономной нервных систем. Kerner также предположил биологическое происхождение данного яда на основании сходства действия токсина с действием атропина и змеиного яда.
В дальнейшем заболевание, возникающее в результате отравления описанным им токсином получило название «ботулизм» от латинского botulus, что означает «колбаса».
МОРФОЛОГИЯ И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
Вегетативные клетки - палочки с закругленными концами размером 4-80,6-0,8 мкм, подвижны (перитрихи). При неблагоприятных условиях образуют эндоспоры, расположенные терминально и субтерминально. Строгие анаэробы; молодые культуры окрашиваются грамположительно, 4-5 -суточные - грамотрицательно. Оптимум рН для роста 7,3-7,6, для прорастания спор 6,0-7,2. Морфология колоний. На кровяном агаре с глюкозой образуют очень мелкие сероватые или мутные желтоватые колонии линзообразной формы (на различных средах у одного и того же штамма могут варьировать). Вокруг колонии образуются зоны гемолиза различной ширины. На печеночном агаре образуют полиморфные звездчатые колонии, на желатине - сероватые, окруженные зоной разжиженного желатина. На столбике агара можно обнаружить диссоциаты, R-формы имеют форму чечевичных зерен, S-формы - пушинок. Хорошо растут на жидких средах (бульонах из гидролизатов казеина, мяса или рыбы) при условии предварительного удаления О2
из среды кипячением в течение 15-20 мин с быстрым охлаждением. Вызывают помутнение среды и газообразование, иногда имеется запах прогорклого масла, но этот признак непостоянен.
БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Все типы Clositridium botulinum образуют желатиназу, лецитиназу и Н2
S, проявляют широкий спектр сахаролитической активности (бактерии типов А, В, Е и F ферментируют глюкозу, фруктозу, мальтозу и сахарозу; типов С и D - глюкозу и мальтозу; тип G инертен к углеводам). Clostridium botulinum типов А и В обладают выраженными протеолитическими свойствами, разлагают свернувшийся яичный белок и гидролизуют желатин По биохимическим свойствам выделяют 4 группы бактерий Cl.botulinum. Бактерии I группы проявляют выраженные протеолитические свойства, гидролизуют желатин и эскулин, ферментируют глюкозу и мальтозу, проявляют липазную активность на яичном агаре. Бактерии II группы проявляют сахаролитическую активность, но лишены протеолитической. Бактерии III группы проявляют липазную активность и гидролизуют желатин. Бактерии IV группы гидролизуют желатин, но, в отличие от прочих возбудителей ботулизма, не проявляют сахаролитических свойств и липазной активности, что послужило основанием для предложения выделить их в отдельный вид - Clostridium argentiense.
ТОКСИНООБРАЗОВАНИЕ
Cl. botulinum продуцирует экзотоксин — наиболее сильный из всех известных бактерийных ядов. Ботулинический токсин по своему действию превосходит химические яды.
Так, токсин типа А в дозе 6 мг способен вызвать гибель мышей общей массой 1 200 000 т. Токсин получен в кристаллическом виде. Он представляет собой глобулин, состоящий из 19 аминокислот. Токсин действует подобно ферментам, он катализирует химические процессы в организме человека и животных с образованием больших количеств ядовитых веществ. В 1 мг кристаллического токсина содержится до 108 DLtn (Dosis letalis minima) для мыши. При благоприятных условиях токсинообразование происходит в культурах, пищевых продуктах (мясных, овощных, рыбных), а также в организме человека и животных. Во многих случаях при наличии клостридий и ботулинических токсинов пищевые продукты по органолептическим показателям не отличаются от доброкачественных.
Все шесть типов ботулинических токсинов вызывают интоксикацию, которая протекает с одинаковой клинической картиной.
Для человека наиболее опасны токсины типов А, В, Е, F, а для животных — токсины типов С и D.
Необходимо иметь в виду, что Cl. botulinum типа Е может размножаться и образовывать токсин при 3 - 5°С. При размножении в пищевых продуктах клостридии типа Е продуцируют не только экзотоксин, но и неядовитый протоксин, который может активизироваться под воздействием трипсина, панкреатина или протеолитических ферментов микроорганизмов и увеличивать активность токсина в десятки, сотни раз.
АНТИГЕННЫЙ СОСТАВ.
Серологические типы возбудителя ботулизма сходны по морфологическим, культуральным свойствам и действию экзотоксинов на организм человека и животных. Но каждый тип токсина отличается друг от друга по своей антигенной структуре. Известны 8 антигенных вариантов ботулотоксина: А, В, C1, C2, D, E, F, G. В микробной клетке клостридий типов A и В выявлены О- и H- антигены. Групповую специфичность внутри типов определяют по наличию антигенов в реакциях с антитоксическими сыворотками. Токсинообразование типов С, D, Е закодировано в геноме конвертируемых бактериофагов и проявляется при интеграции профага в бактериальную хромосому; у остальных типов генетический контроль осуществляет непосредственно хромосома клетки.
Заболевания человека вызывают ботулотоксины типов А, В, Е, а также F. В организме человека С. botulinum размножаются слабо и не продуцируют токсина за редким исключением. Ботулотоксин накапливается в пищевых продуктах, инфицированных спорами С. botulunum, при их прорастании, если созданы анаэробные условия (например при консервировании). Для человека ботулотоксин — самый сильнодействующий бактериальный яд, губительно действующий в дозе 10−8
мг/кг. Споры C. botulinum выдерживают кипячение в течение 6 часов, стерилизация при высоком давлении разрушает их через 20 минут, 10%-ная соляная кислота — через 1 час, 50%-ный формалин через 24 часа. Ботулинический токсин типа А (В) полностью разрушается при кипячении в течение 25 минут.
Токсин представляет собой полипептидную цепь с одной или несколькими внутримолекулярными связями, его молекулярная масса равна 150 000, он относится к бинарным токсинам.
Ботулотоксины всех типов продуцируются в виде токсичных белковых комплексов, состоящих из нейротоксина и нетоксичного белка. Белок является стабилизатором токсина, защищает его от разрушающего действия протеолитических ферментов и НCl.
Ботулотоксин в виде высокомолекулярного комплекса малотоксичен и является прототоксином. В результате мягкого протеолиза, осуществляемого у большинства типов токсина собственными эндогенными протеазами, а у типа Е экзогенными протеазами (например трипсином), прототоксин распадается на 2 субкомпонента: L-лёгкий и Н-тяжёлый. Между ними сохраняется дисульфидная связь. L-суб-компонент соответствует фрагменту А (активатор) и оказывает токсическое действие на клетку-мишень (мотонейрон). Н-субкомпонент соответствует фрагменту В (акцептор) и осуществляет прикрепление к рецептору клетки-мишени.
УСТОЙЧИВОСТЬ
Возбудитель ботулизма широко распространен в природе. Часто встречается в почве, навозе, воде, в иле заболоченных водоемов, в кишечнике животных, рыб, грызунов. Вегетативная форма Cl botulinum довольно быстро погибает под воздействием различных факторов внешней среды. При 80°С возбудитель гибнет через 30 мин. Споры клостридий термостабильны и могут продолжительное время сохраняться в пищевых продуктах и внешней среде. Бактерии типов А и В, выдерживают температуру в 100°С в течение 6 часов, при 105°С отмирают через два часа, при 120°С - через 30 минут. Наименее устойчивы к температуре споровая форма бактерии типа Е. При 100°С она отмирает примерно через 2 минуты, при 80°С - через 40 минут. В высушенном состоянии споры остаются жизнеспособными многие годы. Длительное время они могут переносить низкие температуры. Так, споры не погибают даже при -190°С. При температуре -15 - -16°С сохраняются в течение 1 года, однако часть их разрушается, вследствие чего освобождается токсин, который может вызвать интоксикации. Фенол в 5%-ной концентрации, 20%-ный раствор формалина убивает споры через 24 ч, 10%-ный раствор соляной кислоты - через 1 ч. В этиловом спирте и 14 - 15%-ном растворе хлористого натрия споры сохраняют жизнеспособность в течение 2 мес.
Но нельзя забывать тот факт, что теплопроводимость любого пищевого продукта иная по сравнению с водой. По данным литературы термоустойчивость спор в консервах «Говядина тушеная» вдвое превышала термоустойчивость таких же споровых форм бактерий, но только в воде. Содержание жира повышает устойчивость спор к температуре.
При консервировании пищевых продуктов методом понижения показателей рН, то есть за счет использования кислой среды (маринады) возможна задержка или даже прекращение роста этих микроорганиз
Учитывая, что болезнетворное действие оказывает токсин, а не сама бактериальная культура (в отличие от возбудителей пищевых токсикоинфекций), необходимо отметить, что сам токсин разрушается при воздействии температуры в 80°С в течение 30-60 минут, а при 100°С за 10-15 минут. В твердых субстратах данная температура разрушает его за 2 часа. В зерне токсин сохраняется в течение нескольких месяцев. Микроорганизм в споровой форме очень устойчив к различным дезинфектантам.
Токсины весьма устойчивы к воздействиям различных физических и химических факторов. Они продолжительное время не разрушаются под действием солнечного света. В жидких культурах они могут сохраняться несколько месяцев, при нагревании до 90°С - 40 мин. Кипячение разрушает токсин через 10-15 мин. В отличие от других бактерийных токсинов ботулинический токсин устойчив к действию желудочного сока и всасывается неизмененным. Токсин, содержащийся в пищевых продуктах, устойчив к высоким концентрациям хлористого натрия, в консервах сохраняется в течение 6-8 мес. Ботулинический токсин прекращает накапливаться только при концентрации поваренной соли в продуктах 8-10%. Щелочи ослабляют активность токсина, при рН 8,5 он разрушается. Низкая температура препятствует его образованию. При температуре ниже 8°С токсин обычно не накапливается. Копчение, вяление, соление и замораживание продуктов не ослабляют его активности. Добавление к фильтрату культуры, содержащей ботулинический токсин, 0,3-0,5%-ного формалина и выдерживание фильтрата в термостате в течение трех недель приводит к полной потере ядовитости. Обезвреженный таким образом токсин получил название анатоксин, который используют для иммунизации животных и человека. Анатоксином проводят также гипериммунизацию лошадей с целью получения гипериммунных сывороток.
ВОСПРИИМЧИВОСТЬ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
К ботулиническому токсину чувствительны лошади, крупный и мелкий рогатый скот, птицы, а также люди. Из лабораторных животных восприимчивы кролики, кошки, морские свинки, щенки собак, мыши. У животных ботулизм чаще возникает в результате поедания растительных кормов, содержащих токсин. Интоксикация человека может возникать в результате потребления консервированных грибов, приготовленных в домашних условиях в герметически закрытых банках и плохо отмытых от почвы. После употребления человеком продуктов, содержащих токсин, он всасывается через желудок и кишечник, поступает в кровь, разносится по всему организму, поражает сердечно-сосудистую систему и клетки спинного и головного мозга. Инкубационный период заболевания составляет 12-24 ч. При ботулизме наблюдаются головокружение, головные боли, нарушение зрения, сопровождающееся расширением зрачков, двоением предметов, паралич глотательной мускулатуры, иногда рвота. Температура тела обычно остается нормальной. Летальность довольно высокая (около 60-85%). Накопление токсина часто происходит не во всем объеме продукта. Поэтому из группы людей, употребляющих этот продукт, могут погибнуть только 1-2 человека.
БОЛЕЗНЕТВОРНОСТЬ (ПАТОГЕННОСТЬ)
Clostridium botulinum различна для различных видов млекопитающих; заболевания человека вызывают бактерии типов А, В, Е и F; Clostridium botulinum типов С и D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана.
Патогенность Cl. botulinum определяется токсином. Токсин, выделяемый палочкой Cl. botulinum, один из самых сильных ядов в мире. По данным Л. Месробяну (1963г.) достаточно 10 мг токсина типа «Д», чтобы убить все население Земного шара. Болезнетворная активность токсина типа «А» такова, что 1 г его достаточно для того, чтобы уничтожить 60 миллиардов мышей, вес которых составляет 1 миллион 200 тысяч тонн. Поэтому главным фактором патогенности возбудителя ботулизма являются продуцируемые им экзотоксины. Хотя они отличаются по своим антигенным свойствам, их биологическая активность одинакова. Все они являются вариантами единого нейротоксина. Установлено, что антигенная специфичность и летальная активность определяются различными детерминантами экзотоксина. Токсины всех известных типов продуцируются в виде токсических белковых комплексов. В зависимости от их молекулярной массы и структуры эти комплексы делят соответственно константам седиментации на 3 группы: 12 S-, 16 S- и 19 S-токсины. 12 S-токсины (М-токсины) состоят из молекулы нейротоксина, ассоциированной с молекулой нетоксического белка, который не обладает гемагглютинирующими свойствами. 16 S-токсины (L-токсины) - структуры, состоящие из М-комплекса и нетоксического белка, который отличается от белка М-комплекса и обладает гемагглютинирующими свойствами. 19 S-токсины (LL-токсины) - наиболее крупные структуры, включающие в себя нейротоксин и нетоксический белок со свойствами гемагглютинина. Клостридии ботулизма типа А могут продуцировать токсические комплексы 3 вариантов: М, L и LL; типов В, С и D - в виде L- и М-токсинов, а типов Е и F - только в виде М-токсинов. Таким образом, одна и та же культура Cl. botulinum может продуцировать несколько типов токсических комплексов. Роль нетоксических белков в составе токсических комплексов заключается в том, что они стабилизируют токсин и защищают его от разрушающего действия протеолитических ферментов и НСl при пероральном заражении. Роль их в патогенезе ботулизма при парентеральном заражении остается невыясненной. Нейротоксические компоненты любого серотипа ботулинических токсинов и любого типа токсического комплекса имеют сходную структуру и биологические свойства. Они синтезируются в виде единой полипептидной цепи с молекулярной массой 150 кД (78-токсин), которая не обладает значительной токсической активностью. Эта полипептидная цепь превращается в активный нейротоксин только после ее разрезания бактериальной протеазой или протеазами кишечного тракта человека. В результате точечного гидролиза возникает структура, состоящая из двух связанных между собой дисульфидными связями цепей - тяжелой, с молекулярной массой 100 кД (Н-цепь), и легкой с молекулярной массой 50 кД (L-цепь). Н-цепь ответственна за прикрепление нейротоксина к рецепторам мембраны клеток, а L-цепь осуществляет специфическое блокирующее действие нейротоксина на холинергическую передачу возбуждения в синапсах. Токсины типов С1 и С2 отличаются друг от друга не только серологически, но еще и тем, что токсина С2 вегетативные формы культур не образуют. Он образуется лишь в период спорообразования, а его активация обеспечивается микробной протеазой. Способность возбудителя ботулизма продуцировать протеолитические ферменты играет важную роль в токсинообразовании. Протеолитические группы возбудителей обеспечивают активацию прототоксинов своими эндогенными протеазами, а активация нейротоксинов, продуцируемых непротеолитическими вариантами серотипов Cl. botulinum, осуществляется экзогенным путем, то есть с помощью протеаз желудочно-кишечного тракта при заражении или in vitro - трипсином. Помимо выраженной нейротоксической активности, различные типы C.botulinum обладают лейкотоксической, гемолитической и лецитиназной активностью. Особенность лейкотоксина заключается в том, что он подавляет фагоцитоз без разрушения лейкоцитов. Различные сроки накопления в культуральной среде, лейкотоксинов, гемотоксинов и лецитиназы при инкубации C.botulinum указывают на то, что они имеют, по-видимому, разную химическую природу. Генетический контроль синтеза ботулинических токсинов изучен слабо. Однако получены данные, которые указывают на то, что способность C.botulinum к синтезу нейротоксинов кодируется привнесенными в ее геном генами конвертирующих профагов.
ДИАГНОСТИКА При подозрении на ботулизм исследуют остатки пищи, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, мочу, испражнения; в случае смерти - содержимое желудка, тонкого отдела кишечника, а также кусочки паренхиматозных органов, лимфатические узлы, спинной и головной мозг. Исследования проводят в двух направлениях: обнаружение ботулинического токсина и получение чистой культуры Cl. botulinum. Наличие токсина в материале устанавливают с помощью биологической пробы и реакции нейтрализации, используя антитоксические сыворотки А, В, С, D, E, F. При постановке биологической пробы лабораторным животным (морские свинки, белые мыши, котята) вводят внутривенно или внутрибрюшинно фильтрат бульонных культур или экстракт из остатков пищи, рвотных масс, промывных вод желудка. Причем одной из групп животных вводят прогретый фильтрат. При наличии токсина в исследуемом материале погибают животные той группы, которым вводили не прогретый фильтрат. Кроме того, лабораторным животным вводят смесь фильтрата исследуемого материала с поливалентной антиботулинической сывороткой. При этом животные не должны погибнуть. Для получения чистой культуры предварительно прогретый при 85°С в течение 15 мин материал высевают на среду Китта-Тароцци и культивируют в анаэробных условиях. При высеве на глюкозно-кровяной агар обращают внимание на колонии с нитевидными отростками и зоной гемолиза, характерные для палочки ботулизма. Выделенную культуру изучают и идентифицируют.
ПРОФИЛАКТИКА БОТУЛИЗМА
Основана на соблюдении гигиенических требований при приготовлении пищевого продукта. Необходимо знать о том, что этот почвенный микроб может попасть в пищевой продукт, приготовляемый для хранения или консервации вместе с частичками земли, но и то, что в мясные изделия он попадает вместе со специями, пряностями (перец, кардамон и т.д.), поваренной солью и другими добавками. Однако это не исключает и другой путь попадания его в мясной продукт из содержимого кишечника при разделке туши или через инструменты, используемые при той же разделке туши. Возможен и иной путь попадания микробов в мясные продукты - от больных животных или непосредственно через мясо, или через кишечное сырье, используемое для производства колбасных изделий. Поэтому и необходимо, прежде чем убить животное, поведение которого свидетельствует, что оно больное, исключить данное опасное заболевание. Необходимо помнить, что в мясном продукте, где содержится микроб или токсин их расположение возможно гнездно, в результате чего одни люди после употребления в пищу данного продукта не заболеют, а другие заболеют. Если микроб находится в консервах, то надо знать, что тепловая обработка не уничтожает его споровую форму, и это способствует его дальнейшему прорастанию в вегетативную форму, производству и накоплению ботулинического токсина. Причем при нагревании продукта уничтожаются микробы - антагонисты (те которые препятствуют развитию этой опасной бактерии и накоплению токсина). Кроме того, из продукта при нагревании частично удаляют воздух, то есть создается питательная среда с малым содержанием кислорода, а это идеальные условия для развития и размножения бактерий Cl. botulinum. Чаще всего внешний вид продуктов, в которых образовался ботулинический токсин, изменяется. Они размягчаются, появляется неприятный запах, образуется газ. В консервах возникает бомбаж, т.е. банка вздувается под действием газа продуцируемого микробами. Такие продукты нельзя использовать в пищу или кормить ими животных.
ОЦЕНКА МЯСА
От больных ботулизмом животных и пищевых продуктов, содержащих данный микроб или его токсин очень жесткая. Животные, больные ботулизмом к убою не допускаются. Мясо, мясные и другие пищевые продукты, в которых обнаружены бактерии Cl.botulinum или их токсин подлежат уничтожению.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В. «Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения» М.: ООО «Полиграфсервис», 2006
2. Корнелаева Р.П. «Микробиологический контроль мяса, мясных продуктов, яиц и яйцепродуктов» : Методические указания. М.: 2000
3. Клевакин В.М., Карцев В.В. «Санитарная микробиология пищевых продуктов» Санкт-Петербург.: 1986
4. Ожередова Н.А. «Санитарная микробиология (Санитарно-микробиологические исследования мяса и мясных продуктов)» Ставрополь: Ставроп. гос. аграр. ун-т, 2008
5. Будагян Ф.Е. «Пищевые токсикозы, токсикоинфекции и их профилактика» М.: Медицина, 1965.
6. Шевченко А.А.; Стрельников В.В.; Шевченко Л.В.; Черных О.Ю. «Пищевые токсикоинфекции и токсикозы» Краснодар: [КубГАУ], 2006
7. Колычев М.Н., Госманов Р.Г. «Ветеринарная микробиология и иммунология» М.: КолосС, 2003
8. Матрозова Р.Г. «Микробиология ботулизма в консервной промышленности» М.: Пищепромиздат, 1980
9. Лекции по курсу «санитарная микробиология», Р.П.Корнелаева, 2009