Г.Н. Чупахина, П.В. Масленников
Проведено исследование накопления антоциановых пигментов, хлорофилла и каротиноидов в листьях зеленых и альбиносных проростков ячменя обыкновенного, экспонируемых при различных световых режимах и субстратах. Показано, что увеличение интенсивности света вызывает усиление накопления антоцианов как в зеленых, так и в альбиносных листьях ячменя, но в меньшей степени, что может отражать частичную зависимость биосинтеза антоцианов от накопления хлорофилла, уровень которого уменьшается при увеличении интенсивности света или в результате действия ингибитора биосинтеза зеленых пигментов – стрептомицина.
Антоцианы – пигменты из группы водно-растворимых флавоноидов, содержащихся в клеточном соке цветов, плодов и листьев растений, окрашивающих их в красный, фиолетовый, голубой цвета и их различные сочетания [1].
Синтезируются данные соединения в цитоплазме и депонируются в клеточные вакуоли при помощи глутатионовой помпы [2]. Антоцианы обнаружены в специальных везикулах – антоцианопластах, хлоропластах, а также в кристаллическом виде в плазме некоторых видов лука и клеточном соке плодов апельсина [3].
Общеизвестный факт активации биосинтеза антоцианов у растений в стрессовых условиях еще не получил глубокого физиолого-биохимического обоснования. Возможно, что антоцианы не несут никакой функциональной нагрузки, а синтезируются как конечный продукт насыщенного флавоноидного пути, получившего вакуолярное ответвление с целью конечного депонирования ненужных растению фенольных соединений.
С другой стороны, антоциановая индукция, вызванная определенными факторами окружающей среды [4], а также предсказуемость появления антоцианинов из года в год в периоды специфических этапов развития листа, их яркая выраженность в особых экологических нишах [5], возможно, способствуют адаптации растительных организмов к тем или иным стрессовым условиям.
В обычных условиях биосинтез антоцианов и зеленых пигментов идет более или менее параллельно, о чем может свидетельствовать сходный характер накопления этих веществ в растениях при воздействии светом на разных этапах развития [6].
Данные о характере накопления антоциановых пигментов в условиях ингибирования биосинтеза основных фотосинтетических пигментов отсутствуют.
В связи с этим целью данной работы явилось изучение биосинтеза антоциановых пигментов в альбиносных и зеленых проростках ячменя. Исследовалось влияние света различной интенсивности на накопление данных пигментов.
Для реализации данной цели нами изучалось содержание антоцианинов, хлорофилла а, хлорофилла b, каротиноидов в зеленых и альбиносных листьях ячменя обыкновенного.
Кроме этого изучалось влияние возможного субстрата биосинтеза антоцианов на их накопление в условиях различного освещения.
Объекты и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали 6 – 20‑дневные зеленые проростки ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare L.) сорта Роланд, а также альбиносные проростки, полученные из семян предварительно обработанных 0,25%-ным раствором стрептомицина, первые листья которых в нижней части (2/3 листа) не синтезировали зеленых пигментов [7]. Растения выращивались при постоянном освещении светом люминесцентных ламп ЛБУ-30 в установке ТКШ-1 Флора, при интенсивности света 5 Дж/м2×с, при 18 – 22 °С.
Для анализа пигментов у альбиносных проростков использовали непигментированную часть, а у зеленых – соответствующий ей нижний участок листа. Срезанные участки листьев основаниями помещались в воду или в 1%-ный раствор глюкозы (альбиносы) и освещались полихроматическим светом различной интенсивности (5 – 25 Дж/м2×с) в течение 48 часов, контрольные – находились в темноте.
Перед опытом растения выдерживались в темноте в течение 24 часов. По истечении времени освещения исследуемых листьев растений определялся уровень антоцианов [8], хлорофилла и каротиноидов спектрофотометрическим методом [9].
Полученные данные обработаны статистически. На рисунках представлены средние арифметические значения из 3 – 6 независимых экспериментов, каждый из которых проведен в трехкратной биологической повторности, их средние квадратичные отклонения, а также кривые аппроксимаций графиков прямых функциональных зависимостей данных величин, их уравнения и величины достоверности аппроксимаций (R^2).
Результаты и обсуждение
Данные, полученные в экспериментах с использованием альбиносных и зеленых растений, показывают, что ингибирование биосинтеза основных фотосинтетических пигментов не затрагивает биосинтез антоцианов в первые дни культивирования (6 – 10 дней). Показано одновременное снижение содержания антоцианов как в альбиносных, так и в зеленых проростках ячменя обыкновенного. В дальнейшем, начиная с 10 – 12-го дня, разница в содержании антоцианов у различно пигментированных растений становилась более заметной и статистически достоверной, достигая максимума к 20-му дню.
Обнаружено более резкое снижение содержания антоцианинов в альбиносных проростках по сравнению с зелеными аналогами: содержание данных пигментов в зеленых листьях ячменя обыкновенного превосходило в 2,9 раза аналогичный уровень в альбиносах (рис. 1).
Рис. 1. Биосинтез антоциановых пигментов
в зеленых и альбиносных проростках ячменя обыкновенного,
выращенных при интенсивности света 5 Дж/м2×с
Проведённые эксперименты по изучению влияния полихроматического света на образование антоциановых пигментов в альбиносных и зеленых участках ячменя показали зависимость образования этих пигментов от величины интенсивности светового потока. Динамика накопления антоцианов в листьях исследуемых растений на свету различной интенсивности представлена на рисунках 2 и 3. Показано, что стимуляция накопления антоцианов нарастает с повышением интенсивности света и превосходит исходный уровень при максимально использованной интенсивности света в 25 Дж/м2×с в зеленых листьях – в 2,8 и в альбиносах – 2,3 раза (рис. 2).
|
|
Рис. 2. Влияние условий освещения
на биосинтез антоцианинов в 20-дневных зеленых и альбиносных
проростках ячменя обыкновенного, экспозиция 48 часов
Кроме того, отмечено усиление накопления антоцианов в альбиносных листьях в присутствии субстрата гликолиза – 1%-ного раствора глюкозы – по сравнению с аналогичными листьями, находящимися на воде при увеличении интенсивности полихроматического света. Наблюдалось возрастание уровня антоцианов в 1,6 раза при максимально использованной интенсивности света в 25 Дж/м2×с (рис. 3). Таким образом, свет стимулирует накопление антоциановых пигментов как в зелёных листьях растений, так и в альбиносных, хотя и в меньшей степени, а при добавлении возможного субстрата биосинтеза антоцианов [10] еще и в большей степени.
|
||
Рис. 3. Биосинтез антоциановых пигментов в 20-дневных альбиносных проростках ячменя обыкновенного на разных субстратах, экспозиция 48 часов
Исследование уровня основных фотосинтетических пигментов в листьях растений, имеющи
|
|
|
|
|
Рис. 4. Влияние освещения на биосинтез пигментов
в 20-дневных альбиносных проростках ячменя обыкновенного:
1 – хлорофилл b; 2 – антоцианы (дополнительная ось);
3 – хлорофилл а; 4 – каротиноиды
|
|
|
|
|
Рис. 5. Влияние освещения на биосинтез пигментов в 20-дневных зеленых проростках ячменя обыкновенного:
1 – антоцианы (дополнительная ось); 2 – хлорофилл а;
3 – хлорофилл b; 4 – каротиноиды
Кроме этого, получены данные об изменениях в соотношении основных групп пигментов изучаемых растений. Показано, что действие стрептомицина способствует увеличению отношения антоцианов и хлорофилла а (рис. 6), антоцианов и хлорофилла b (рис. 7) в альбиносных проростках ячменя. В противоположность этому отношение хлорофилл а и b в альбиносах уменьшается по сравнению с зелеными аналогами (рис. 8).
|
|
Рис. 6. Влияние условий освещения на соотношение
антоцианы/хлорофилл а в 20-дневных зеленых и альбиносных
проростках ячменя обыкновенного, экспозиция 48 часов
Рис. 7. Влияние условий освещения на соотношение
антоцианы/хлорофилл b в 20-дневных зеленых и альбиносных проростках ячменя обыкновенного, экспозиция 48 часов
Рис. 8. Влияние условий освещения на соотношение хлорофилл а/b
в 20-дневных зеленых и альбиносных проростках
ячменя обыкновенного, экспозиция 48 часов
Увеличение интенсивности света вызывает увеличение данных показателей как в альбиносных, так и в зеленых проростках, за исключением отношения хлорофилл a/b, уменьшающегося в листьях ячменя обыкновенного.
Таким образом, увеличение интенсивности света вызывает усиление накопления антоциановых пигментов как в зеленых, так и в альбиносных листьях ячменя, но в меньшей степени, что может отражать частичную зависимость биосинтеза антоцианов от уровня хлорофилла, обусловливая возможное субстратное взаимодействие между уровнем сахаров и флавоноидов в растительной клетке.
Зависимость накопления антоцианов от фотосинтетических продуктов также подтверждается в экспериментах с добавлением субстрата гликолиза – 1%-ного раствора глюкозы, стимулирующего накопление последних в альбиносных проростках по сравнению с контролем (вода).
Физиологическая роль и механизм индукции биосинтеза антоцианов ещё не вполне выяснены. Обнаруженная закономерность накопления в зеленых и альбиносных листьях ячменя антоцианов, локализованных главным образом в эпидермальных тканях, при увеличении интенсивности света может свидетельствовать о выполнении данными пигментами защитной функции в отношении фотосинтетической системы хлоропластов и ДНК генома клетки [11]. Экранирование активных центров мембранных пигментов и белков фотосистемы II антоцианами от избыточных потоков света высокой интенсивности также может защитить фотосинтетический аппарат от фотоокислительных процессов. Кроме этого, устойчивость растений к ингибированию светом высокой интенсивности может быть связана с повышением эффективности поглощения световой радиации в красной области спектра и предохранением светособирающего комплекса (ССК) от действия свободно-радикальных частиц [11; 12]. Увеличение уровня антоциановых пигментов в зеленых и альбиносных листьях может быть связано с поглощением дополнительной световой энергии, которая может иметь отношение и к активируемым светом реакциям дыхательного метаболизма, учитывая, что митохондриальные цитохромы имеют полосу поглощения в зелёной области спектра, или может использоваться для стимуляции биосинтеза аскорбиновой кислоты (АК), спектр действия которой совпадает с максимумом поглощения антоциановых пигментов [13]. Активация биосинтеза антоциановых пигментов также может увеличить фотосинтетическую способность альбиносных тканей, имеющих следовое количество зеленых пигментов.
Список
литературы
1. Harborn J.B. The flavonoids: recent advances // Plant pigments / Ed. T.W. Goodwin. London: Academic Press, 1988. P. 229 – 343.
2. Mars K.A., Alfenito M.R., Lloyd A.M., Walbot V. A Glutathione S‑transferase involved in vacuolar transfer encoded by the maize gene bronze-2 // Nature. 1995. V. 375. Р. 397 – 400.
3. Rogerson F.S., Vale E., Grande H.J., Silva M.C. Alternative processing of Port-Wine using pectolytic enzymes // Cienc. tecnol. aliment. 2000. V. 2. P. 222 – 227.
4. Chalker-Scott L. Environmental significance of anthocyanins in plant stress responses // Photochemistry and photobiology. 1999. V. 70. P. 1 – 9.
5. Lee D.W., Brammeier S., Smith A.P. The Selective advantages of anthocyanins in developing leaves of mango and cacao // Biotropica. 1987. V. 19. P. 40–49.
6. Волынец А.А., Прохорчик Р.А. Ароматические оксисоединения – продукты и регуляторы фотосинтеза. Минск: Наука и техника, 1983.
7. Чупахина Г.Н. Физиологические и биохимические методы анализа растений: Практикум. Калининград: Изд-во КГУ, 2000.
8. Муравьёва Д.А., Бубенчикова В.Н., Беликов В.В. Спектрофотометрическое определение суммы антоцианов в цветках василька синего // Фармакология. 1987. Т. 36. С. 28 – 29.
9. Окунцов М.М. Специальный практикум по биохимии и физиологии. Томск: Изд-во ТГУ, 1974.
10. Wiebold B. The color purple // Integrated pest and management newsletter / University of Missouri-Columbia. 2000. V. 10. №4. Art. 3. P. 1.
11. Gould K.S., Kuhn D.N., Lee D.W., Oberbauer S.F. Why leaves are sometimes red // Nature. 1995. V. уц378. P. 241 – 242.
12. Yamasaki H. A Function of colour // Trends in plant science. 1997. V. 2. P. 7 – 8.
13. Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений: Монография / Калининградский государственный университет. Калининград, 1997.