Зміст
Вступ
1. Наночастки та їхня характеристика
2. Застосування колоїду наночасток Ag, Cu, Zn, Mg для лікування тварин, уражених гнійним артритом
3. Ефективність застосування наночасток металів в ортопедії
4. Застосування наночасток металів для лікування хвороб копитець заразної етіології
5. Лікувальна ефективність очних желатинових плівок із наночастками металів
6. Дезінвазія тваринницьких приміщень аніоноподібними наночастами металів
7. Дезінвазія ґрунту наночастками магнію
8. Застосуванням наночасток металів для дезінвазії каналізаційних стоків
Список літератури
Вступ
У наш час все частіше застосовують наночастки металів у біологічній, ветеринарній та медичній практиках.
Серед переваг характерних для наноречовин слід виділити їхню біологічну сумісність та екологічну чистоту, завдяки яким можна значно розширити спектр застосування продуктів нанотехнології у різних галузях народного господарства та медицині.
Продукти нанотехнології лише починають завойовувати український ринок. Проте на промисловому рівні виготовляються нанорозчини біоцидних металів для дезінфекції тваринницьких приміщень, знезараження води, а також пакувальний матеріал для продуктів харчування тощо.
Пошук методів лікування та профілактики хвороб тварин, оснований на застосуванні наночасток металів, представляє важливий науковий і практичний інтерес.
Серед великого спектра хвороб тварин, слід виділити паразитарні та хірургічну патологію.
Широкий вибір антгельмінтиків, представлений нині на ринку ветеринарних засобів України, не дозволяє у повній мірі забезпечити паразитарне благополуччя. Контаміновані яйцями та личинками паразитів гній, ґрунт, вода, предмети догляду за тваринами, станки, годівниці тощо є факторами передачі паразитозів. Розробка ефективних та екологічно чистих засобів дезінвазії дозволить перервати епізоотологічний ланцюг і запобігти поширенню паразитарних хвороб тварин.
Хірургічні хвороби реєструються в 21–23 % випадків усіх хворих тварин. Переважно це рани, гнійне запалення суглобів, ураження копит і копитець тощо. Лікування тварин із цими ураженнями є важливою науковою проблемою, що має велике практичне значення.
1.
Характеристика наночасток
Серед різноманітних видів і методів отримання наночасток на особливу увагу заслуговують розробки українських дослідників, які отримали електрично заряджені наночастки. Основою ерозійно-вибухової нанотехнології є фізичне явище самоконцентрації енергії.
Найбільший інтерес представляють ерозійно-вибухові нанотехнології, за допомогою яких були синтезовані нові електрично заряджені колоїди наночасток металів. У якості комплексоутворювача в них виступають наночастки мікроелементів із поверхневим електричним зарядом зі знаком «мінус», а в ролі лігандів – молекули води або інших хімічних елементів. Це новий клас комплексних сполук із координаційним числом, більшим за 12, що досягається відповідною електризацією наночасток.
Наночастки утворюються при вибухах локальних ділянок металевих гранул у процесі електроімпульсної абляції у воді. В результаті вибуху утворюються потужні потоки електронів, у яких знаходяться наночастки. Навколо них утворюється поверхневий електричний заряд із знаком «мінус». За структурною будовою наночастки є подібні до аніонного хелатного комплексу через наявність у металевих наночастках поверхневого електричного заряду зі знаком «мінус», але при цьому виключаються токсичні прояви через відсутність аніона.
Надзвичайно цікавою є розробка ТОВ «Наноматеріали і нанотехнології», технологія на створення наночасток різнорідних металів у вигляді структурованих агломератів наночасток різних розмірів, які знаходяться між собою в електричному контакті. Їх отримують при певних режимах ерозійно-вибухового диспергування металевих гранул різнорідних металів (не менше двох). Причому, електричне поле частинок меншого розміру має більший градієнт потенціалу, ніж частинок великого розміру. При близькому розташуванні малих і великих частинок за рахунок електростатичної індукції на локальних ділянках поверхні великої частинки, напроти малої частинки, утворюються наведені (індуковані) заряди протилежного знаку (щодо знака заряду частинки меншого розміру). Тому на поверхні великої частинки «налипають» дрібні частинки, які знаходяться між собою в електричному контакті. Це дозволяє задіювати електрохімічні явища за рахунок використання металів із різними електрохімічними потенціалами. При цьому підвищується активність хелатного аквананохелату. В якості комплексоутворювача поліметалевого хелатного аквананокомплексу виступають наночастинки різнорідних металів. Оптимальне співвідношення середніх розмірів наночастинок різнорідних металів знаходиться в межах 5–20. Це дозволяє, з одного боку, отримати стійкий хелатний аквананокомплекс, а з іншого забезпечити оптимальне покриття поверхні великих наночастинок малими наночастинками і тим самим не обмежувати контакт великої частинки із зовнішнім середовищем і, відповідно, не перешкоджати прояву електрохімічних властивостей поліметалевого хелатного аквананокомплексу.
При створенні та промисловому виробництві наночасток за допомогою ерозійно-вибухової технології основний акцент був націлений на біоцидні метали (Ag, Cu, Zn, Mg та ін.). На основі колоїдного срібла й міді розроблені засоби для дезінфекції та консервації питної води, фільтри й мембрани для очистки соків, пива, вина та повітря. Наноматеріал «шумерське срібло», до складу якого входять наночастки срібла і міді ефективно проявив себе при знезараженні приміщень діючого свинокомплексу та птахофабрики.
Унікальні структура і властивості наноматеріалів, отриманих методом ерозійно-вибухових технологій, відкривають перед дослідниками широкі можливості щодо їх застосування, в тому числі з метою запобігання та ліквідації найпоширеніших хвороб тварин.
2.
Застосування колоїду наночасток Ag, Cu, Zn, Mg для лікування тварин, уражених гнійним артритом
У тварин гнійні артрити діагностуються в 22 – 23 % випадків від загального числа уражень суглобів. Найчастіше уражуються копитні суглоби. Гнійний подоартрит виникає внаслідок поранень або метастатичного занесення інфекта в суглоб (первинно), а також у зв’язку з флегмоною вінчика, гнійним пододерматитом, гнійним подотрохлеїтом (вторинно). Поетапно спостерігається гнійний синовіт (емпієма), гнійний артрит, параартикулярна флегмона, гнійний остеоартрит.
Лікування проводили за модифікованим методом Б. С. Семенова (1981). Тварин фіксували в стоячому положенні. Внутрішньо м’язово вводили 7 – 10 мл 2,5 %-ного розчину супрастину (діє антиалергічно). Виконували артоцентез з боку найбільш виповненого дивертикула, видаляли ексудат, промивали розчином етакридину лактату. Після повного видалення рідини для промивання у контролі в суглоб уводили 20 мг хімотрипсину або 50 мг хімопсину (лізують внутрішньосуглобове випадання фібрину) з 1 г неоміцину сульфату, розчинених у 5 мл 0,5 %-ного розчину новокаїну. Лікувальну обробку повторювали тричі з добовим інтервалом.
У дослідних у тварин-аналогів внутрішньосуглобові ін’єкції антибіотика заміняли інтраартикулярними введеннями 5 мл колоїду наночасток Ag, Cu, Zn, Mg, Co.
У контролі клінічне видужування тварин і відновлення функції кінцівки наставало через 13±2,5 доби від дня виникнення захворювання. Протягом перших 6–7 діб перебігу захворювання у тварин діагностували пригнічення, гарячку, понаднормове прискорення пульсу й дихання.
У досліді клінічне видужування тварин і відновлення функції кінцівки наставало через 8±1,5 доби. Деяке пригнічення, прискорення пульсу і дихання відмічали тільки протягом перших 3–4 діб. При обстеженні суглобів реєстрували швидке розсмоктування запального набряку, виражену флуктуацію на початку лікування і відсутність її при його закінченні.
Інтимні зміни морфофункціональних характеристик стану суглоба чітко маркіруються цитологічними дослідженнями суглобового вмісту (табл.1).
Таблиця 1
Синовіоцитограма при гнійному синовіті до та після лікування, n=5
| Дослідження | Синовіо- цити |
Гістіоцити |
Лімфоцити | Моноцит/ макрофаги |
Нейтрофіли | Дистрофічні клітини |
| До лікування | 2,8±0,36 | 3,0±0,67 | 5,0±0,90 | 3,8±0,36 | 73,8±1,48 | 11,6±0,49 |
Через 3 доби від початку лікування: а) антибіотиком, б) наночастками металів |
3,0±0,45 4,8±0,36 * |
4,2±0,58 5,6±0,49 * |
8,2±0,36 9,4±0,27 * |
4,6±0,40 5,4±0,49 |
69,0±0,67 65,4±0,72 ** |
11,0±0,45 9,4±0,27 * |
Через 9 діб від початку лікування: а) антибіотиком, б) наночастками металів |
4,4±0,49 29,8±1,03 *** |
5,4±0,49 6,4±0,63 * |
8,6±0,27 35,0±0,45 *** |
22,4±0,49 5,2±0,8 *** |
50,0±0,90 19,4±2,50 *** |
9,2±0,36 4,2±0,58 *** |
Через 15 діб від початку лікування: а) антибіотиком, б) наночастками металів |
22,6±1,61 38,4±1,17 *** |
7,2±0,36 11,0±0,67 *** |
25,4±0,96 40,0±0,67 *** |
18,0±2,02 3,6±0,49 *** |
21,4±3,99 5,0±0,67 *** |
5,4±0,72 1,6±0,27 *** |
П р и м і т к а: 1. * – р<0,05;
2. ** – p<0,01;
3. *** – p<0,001, порівняно з контролем.
За даними таблиці 1, вже на 3-тю добу спостережень усі показники синовіоцитограми в досліді достовірно відрізнялись від аналогічних показників у контролі за винятком вмісту моноцит/макрофагів, засвідчуючи переваги застосування при гнійному артриті наночасток металів.
На 9-ту добу спостережень ця тенденція значно посилилась (за винятком вмісту гістіоцитів) і вже на 15-ту добу без будь-яких виключень досягала апогею. При цьому в синовіоцитограмі при застосуванні наночасток, порівняно з долікувальним періодом, вміст синовіоцитів збільшився в 13,7 разів і в цей же період часу перевищив контроль на 33,1 %. Аналогічно вміст гістіоцитів збільшився у 3,67 разів, а порівняно з контролем – у 2,62 рази; вміст лімфоцитів – у 8 разів і на 36,5 %; збільшений вміст моноцит-макрофагів, порівняно з долікувальним періодом, повністю нормалізувався і був меншим за контроль, у якому все ще зберігались цитологічні ознаки запалення, у 5 разів.
Вміст нейтрофілів, як основної цитологічної ознаки гнійного запалення, аналогічно зменшився у 14,75 та у 4,28 разів. Разом з тим зменшився вміст дистрофічно змінених клітин порівняно з долікувальним періодом у 7,25 рази, а порівняно з контролем – у 3,37 разів.
Таким чином, дані синовіоцитограми об’єктивно засвідчують незаперечні переваги місцевого застосування при гнійних артритах колоїду наночасток порівняно з антибіотикотерапією (переважно за рахунок наносрібла з його вираженими антисептичними властивостями). В першу чергу це пояснюється неможливістю утворення резистентності мікроорганізмів проти наночасток, у той час як стійкість бактерій проти антибіотиків постійно зростає й поширюється.
Крім того, слід ураховувати участь наночасток Cu, Zn, Mg, Co, як коферментів металів, у багатьох біохімічних реакціях, перебіг яких відображається в цитологічних характеристиках синовіоцитограм.
Отже, застосування колоїду наночасток Ag, Cu, Zn, Mg, Co характеризується синергічною дією двох аспектів нанотерапії – антисептичного й біохімічно-стимулювального, сумарна дія яких і забезпечує високу ефективність (85 – 89 %) виліковування хворих тварин навіть за такої тяжкої патології як гнійний синовіт.
Гематологічними дослідженнями виявлено чітку реакцію цілісного тваринного організму як на септичне ураження суглоба, так і на перебіг змін, пов’язаних із лікуванням хвороби (табл. 2).
Таблиця 2
Гематологічні показники при місцевому лікуванні гнійного синові ту, n=5
| Дослідження | Еритроцити, Т/л | Гемоглобін, г/л | Лейкоцити,Г/л |
| Лікування | 4,68±0,04 |
80,2±1,48 |
17,0±0,67 |
Через 3 доби від початку лікування: а) антибіотиком, б) наночастками металів |
4,8±0,04* 5,0±0,04*** |
86,4±1,30* 90,2±1,03*** |
14,8±0,58* 12,0±0,67*** |
Через 9 діб від початку лікування: а) антибіотиком, б) наночастками металів |
4,98±0,06** 5,44±0,06* |
92,0±0,90* 99,9±1,25*** |
11,4±0,40*** 9,6±0,49*** |
Через 15 діб від початку ліування: а)антибіотиком, б) наночастками металів |
5,2±0,07* 6,22±0,15*** |
96,8±1,48** 114,0±1,19*** |
10,0±0,22 8,4±0,27** |
Примітка: 1. * – р<0,05;
2.** – p<0,01;
3.*** – p<0,001, порівняно з попереднім періодом часу
Як свідчать дані таблиці 2, перебіг гнійного артриту супроводжувався позанормованим зниженням у крові вмісту еритроцитів і гемоглобіну та збільшенням вмісту еритроцитів, що, очевидно, зумовлено токсичним впливом гнійного запалення. Через 3 доби від початку лікування із використанням антибіотика відмічено достовірне збільшення в крові вмісту еритроцитів і гемоглобіну. Проте воно залишалось нижчим за норму. Крім того, спостерігалося достовірне зменшення кількості лейкоцитів, вміст яких все ще був більшим верхнього показника норми. При використанні наночасток металів вміст еритроцитів у середньому досяг нижньої межі норми; вміст гемоглобіну, хоча достовірно й збільшився, проте все ще був меншим за норму; вміст лейкоцитів у середньому знизився до верхньої межі норми.
Отже. введення в суглоб колоїду наноаквахелатів металів не проявляє пошкоджуючої дії на його структурно-функціональні характеристики; введення в суглоб гідрокортизону ацетату в деяких випадках призводить до переходу асептичного запалення у гнійне.
При внутрішньосуглобовому введенні колоїду наночасток металів хворі на асептичний синовіт тварини видужували в 97,5 % випадків.
Внутрішньосуглобове введення колоїду наночасток металів при гнійному синовіті супроводжується виліковуванням хворих тварин у 85 – 89 % випадків.
3. Ефективність застосування наночасток металів в ортопедії
Хвороби копитець у корів діагностуються відносно часто; вони завдають скотарству значних економічних збитків (зниження продуктивності, недоотримання приплоду, вимушене вибраковування тощо). Так, у Росії економічні втрати від хвороб копитець у корів становлять 800 – 900 млн. карбованців на рік, в Україні ці збитки досягають 100 – 200 млн. гривень. Найбільш загрозливими є ураження копитець заразної етіології, при яких удосконалення лікувальних заходів набувають значної актуальності.
Опорна здатність копитець корів багато в чому залежить від щільності й твердості копитцевого рога, які забезпечуються біохімічними процесами в епідермісі копитець. При зниженні біофізичних показників останнього травмується основа шкіри копитець і виникає пододерматит.
Досліджували копитця корів-аналогів чорно-рябої породи, віком 4–5 років, продуктивністю 5000 кг молока на рік; на час досліджень корови були яловими. До першої групи були включені тварини, яких утримували на дерев’яній підлозі; до другої – корови, яких утримували за аналогічних умов, але копитця яких піддавали періодичній обробці колоїдом наночасток металів; до третьої – тварини, яких утримували на бетонній підлозі; до четвертої групи – корови, яких утримували за таких же умов, але копитця яких періодично обробляли наночастками металів.
Через місяць від початку дослідів із підошовної ділянки копитець були відібрані шматочки рогу для біохімічних і біофізичних досліджень.
Вміст міді та цинку в роговому матеріалі визначали методом атомно-абсорбційної спектрометрії, білок – на апараті К’єльдаля, сірку та SH-групи – хімічними методами, вологу – стабільним висушуванням, а кількість попелу – спалюванням зразків у муфельній печі. Показник щільності визначали методом гідростатичного зважування; твердість копитцевого рогу – за методом Бринеля, а опір проти стирання – за допомогою спеціального приладу УкрНІКП.
У дослідженні використовували колоїд наночасток Ag, Cu, Zn, отриманих методом ерозивно-вибухового диспергування біоцидних і біогенних металів.
Цифрові дані обробляли методом варіаційної статистики із застосуванням t-критерію Стьюдента за програмою «Статистика».
Вміст мінеральних речовин у роговому матеріалі копитець представлено в табл. 3
Таблиця 3
Вміст мінеральних речовин у копитцевому розі корів, n=5
| Показники | Сірка, г/кг | Мідь, мг/кг | Цинк, мг/кг |
При утриманні на дерев’яній підлозі, контроль; При утриманні на дерев’яній підлозі з обробкою наночастками металів |
18,8±0,46 22,0±1,12* |
27,8±1,43 32,6±0,72* |
17,6±1,61 23,2±0,81* |
При утриманні на бетонній підлозі, контроль; При утриманні на бетонній підлозі з обробкою наночастками |
20,6±0,85 23,2±0,76* |
29,4±0,85 34,0±1,12** |
19,0±1,12 23,8±0,36** |
Примітка: 1. * – p<0,05;
2. ** – p<0,01.
Як свідчать дані табл. 3, при утриманні корів на дерев’яній підлозі обробка копитець наночастками металів супроводжується збільшенням вмісту сірки на 14,55 %, міді – на 14,72, цинку – на 24,14 %.
При утриманні тварин на бетонній підлозі обробка копитець наночастками металів супроводжується збільшенням вмісту сірки на 11,21 %, міді – на 13,53, цинку – на 20,17 %.
Обробка копитець наночастками металів супроводжується покращенням біохімічних і біофізичних характеристик копитцевого рога (табл. 4).
Таблиця 4
Біохімічні та біофізичні показники копитець рога при утриманні корів на підлогах різних типів у контролі та при обробці наночастками металів, n=5
| Показники | Утримання на дерев’яній підлозі, контроль | Обробка наночастками при утриманні на дерев’яній підлозі | Утримання на бетонній підлозі, контроль | Обробка наночастками при утриманні на бетонній підлозі |
| Волога, % | 33,2±1,48 | 27,4±0,85** | 26,6±0,49 | 21,0±2,12** |
| Попіл, % | 1,14±0,04 | 1,26±0,03* | 1,18±0,04 | 1,36±0,05* |
| Білок, % | 88,0±0,9 | 92,6±1,17* | 91,8±0,40 | 93,0±0,22* |
| SH-групи, мкмоль/г | 31,4±0,72 | 35,2±0,58** | 32,2±1,03 | 36,4±0,40** |
Щільність, г/см3
|
1,08±0,01 |
1,15±0,02** |
1,10±0,01 |
1,18±0,008*** |
Твердість, кгс/см3
|
147,4±1,17 |
154,0±1,12** |
155,0±0,67 |
160,2±0,55*** |
| Опір проти стирання, об/мм | 95,4±0,72 |
114,8±1,08*** |
104,8±1,93 |
117,0±2,02** |
1.* – p<0,05;
2. ** – p<0,01;
3. *** – p<0,001.
Як свідчать дані табл. 4, при утриманні корів на дерев’яній підлозі при обробці копитець наночастками металів у роговому матеріалі зменшується вміст вологи зменшується на 18,01 %, вміст попелу збільшуються на 9,05, білку – на 9,52, сульфгідрильних груп – на 8,92, щільність – на 9,39, твердість – на 9,57, опір проти стирання на 8,31 %.
При утриманні на бетонній підлозі при обробці копитець наночастками металів вміст вологи зменшується на 21,05 %, вміст попелу збільшуються на 8,68, білка – на 9,87, сульфгідрильних груп – на 8,85, щільність – на 9,32 %, твердість – на 9,67 %, опір проти стирання – на 8,96 %.
Таким чином, обробка копитець наночастками металів супроводжується суттєвими змінами як біохімічних, так і біофізичних характеристик копитцевого рогу. Копитцевий ріг ущільнюється, в ньому зменшується вміст вологи, за рахунок чого зростає вміст усіх досліджених біохімічних показників і значно покращуються основні біофізичні параметри.
Крім того, наночастки металів виразно впливають на перебіг кератиногенезу, основу якого становить перехід сульфгідрильних груп цистеїну в дисульфідні групи цистину з їх подвійними зв’язками. За рахунок цього відбувається укріплення біохімічної й біофізичної структур білкових молекул копитцевого рогу:
R – НS + SН – R – S = S – R + 2Н (Н2
О)↓.
Перебіг процесу кератинізації потребує кофакторної дії, в першу чергу таких металів як мідь і цинк. Вплив наноміді та наноцинку на кератинізацію набагато вираженіший, ніж дія цих металів у молекулярному масштабі. Останнє чітко проявляється в порівняльному досліді, за якого копитця в контролі обробляли 10 %-вим розчином міді сульфату в суміші з цинком сульфатом. Початкові контрольні й дослідні біохімічні і біофізичні показники були ідентичними. Обробка солями й наночастками міді та цинку тривала 3 дні по 30 хв тричі на день. Результати враховували через 5 днів (табл. 5).
Таким чином, обробка копитець колоїдом наноміді та наноцинку, порівняно з їх обробкою розчином солей міді й цинку, достовірно покращує біохімічні і біофізичні показники копитець за виключенням вмісту сірки та зволоженості копитцевого рогу, які відносно мало впливають на інші його якості. Так, вміст міді збільшився на 10,3 %, цинку – на 24,55, попелу – на 7,63, білка – на 4,15, сульфгідрильних груп – на 7,19, щільність – на 4,51, твердість – на 3,58, опір проти стирання на 9,4 %.
Таблиця 5
Показники основних якостей копитцевого рогу при обробці солями й наночастками міді та цинку, n=5
| Показники | Обробка 10 %-вим розчином сульфатів міді й цинку | Обробка наночастками міді та цинку |
| Сірка, г/кг | 23,4±0,49 | 22,0±1,34 |
| Мідь, мг/кг | 28,0±0,45 | 31,2±0,81** |
| Цинк, мг/кг | 16,6±1,52 | 22,0±0,89* |
| Волога, % | 31,6±1,08 | 32,0±0,89 |
| Попіл, % | 1,09±1,18 | 1,18±0,01* |
| Білок, % | 87,8±0,99 | 91,6±1,39* |
| SH-групи, мкмоль/г | 31,0±0,45 | 33,4±0,72* |
| Щільність, г/см3
|
1,06±0,02 | 1,11±0,002* |
| Твердість, кгс/см2
|
145,6±0,85 | 151,0±0,89** |
| Опір проти стирання, об/мм | 92,4±1,17 | 102,0±2,47** |
Примітка: 1.* – p<0,05;
2. ** – p<0,01.
Отже, наночастки Cu і Zn при обробці копитець включаються в процеси кератинізації, в той час як обробка солями міді й цинку супроводжується лише певним, у якійсь мірі, поверхневим просякненням рогу, яке досить швидко зникає під впливом вологи підлог.
Стимулювальний вплив комплексу наноаквахелатів Ag, Cu, Zn зумовлений специфічною активністю кожної складової.
Срібло має виражені антисептичні властивості. Воно пригнічує кератолітичну дію патогенної мікрофлори та грибів.
Мідь приймає участь у багатьох біохімічних процесах як складова частина ферментоактивних білків, які переносять електрони в реакціях окиснення та відновлення органічних субстратів.
Цинк забезпечує перебіг транспортних процесів, пов’язаних із металоензимними перетвореннями значної кількості біохімічних сполук. Разом з міддю він виражено впливає на синтез кератинових білків. Іонний радіус цинку менший ніж у міді, у зв’язку з чим цинк несе концентрованіший заряд, порівняно з міддю, що зумовлює його більшу спорідненість до електронів. Це забезпечує широку участь цинку в різних біологічних процесах, таких як гідроліз, приєднання до подвійних зв’язків, окиснення – відновлення тощо.
Висока метаболічна активність наноміді й наноцинку, що проявляється у вираженій оптимізації біохімічних і біофізичних показників копитцевого рогу, зумовлена наявністю у наночасток корпускулярного, хвильового та квантового ефектів, чого не може бути у мікроелементів у молекулярній формі. Дія наночасток цілком узгоджується із законами квантової фізики щодо поводження часток такого роду в перебізі різних біохімічних процесів, зокрема кератинізації. Різноманітні часточки, які знаходяться в розчині або суспензії у формі атомів, електронів і, можливо, в інших дещо менших за розмірами часток, проявляють ті ж самі властивості, що й електрони у класичному фізичному аспекті. У перебізі фізико-хімічних реакцій наночастки виступають у якості потужного донора та діють як сильні стимулятори перебігу фізичних і хімічних явищ.
Отже, обробка рогу копитець аквахелатом наносрібла, наноміді, наноцинку супроводжується збільшенням вмісту сірки, міді й цинку та значним покращенням біофізичних показників копитцевого рогу, що набагато перевищує біохімічні й біофізичні характеристики копитцевого рогу порівняно з обробкою 10 %-вим розчином міді сульфату і цинку сульфату. Це пояснюється включенням екзогенних наночасток у перебіг біохімічних реакцій епідермісу копитець.
4. Застосування наночасток металів для лікування хвороб копитець заразної етіології
Заразні хвороби копитець корів досліджували в господарствах Київської, Чернігівської, Черкаської та Полтавської областей за допомогою клінічних (огляд, пальпація, перкусія), бактеріологічних з ідентифікацією мікроорганізмів згідно визначника Берджі (1997) та мікологічних методів. За принципом аналогів корів із неспецифічними гнійно-некротичними ураженнями, некробактеріозом і кератомікозами розподілили на контрольну та дослідну групи для кожної окремої нозології.
При неспецифічних гнійно-некротичних ураженнях, некробактеріозі та кератомікозній патології хворих корів ізолювали, ставили в чисті продезінфіковані станки. Потім на старанно очищені копитця і застосовували накладали просочені лікувальними препаратами серветки, які фіксували захисною пов’язкою. Обробки повторювали з інтервалом 3 – 4 дні до повного зникнення клінічних ознак ураження (некротичні вогнища, виразки, розпад копитцевого рогу, кульгання тощо). Для корів контрольних груп серветки просочували фенол-скипидар-димексидною емульсією, для корів дослідних груп – сумішю колоїдів нанокластерів Ag, Cu, Zn, Mg. Суміш колоїдів металів – це двокомпонентна система з деіонізованої води та часток металів у нанорозмірному стані (1,0 – 50,0 нм). Колоїд мав слабокислу реакцію з рН 6,7 – 6,9, вміст металів від 10 до 100 мг/л. Отриманий фізичним методом, даний колоїд значно відрізнявся від колоїдів Ag, Cu, Zn, Mg, отриманих хімічним або електролізним способом, де іони металів діють токсично і тому при лікуванні використовуються досить обмежено.
У якості етіологічного фактора при неспецифічних гнійно-некротичних ураженнях копитець виявляли асоціації умовно-патогенної мікрофлори, до складу яких входили стафілококи, стрептококи, диплококи, протей, кишкова паличка та досить патогенні мікроорганізми – Clostridium perfringens тип А, Corynebacterium piogenes.
Спостерігали ерозії, виразки та поверхневе нагноєння з наявністю вогнищ некрозу в ділянках шкіри міжпальцевого склепіння, кайми, м’якушів. Встановлювали майже повну відсутність утворення грануляційного бар’єру, у зв’язку з чим ураження було м’яким і при натисненні з нього виділявся гнійний ексудат. При відсутності лікування гнійно-некротичне ураження прогресувало, поширюючись на підшкірну клітковину, бурси, сухожилкові піхви, сухожилки і зв’язки пальців, а згодом на суглоби й кістки. При цьому хвора тварина втрачала можливість спирання на уражену кінцівку.
У випадках постановки діагнозу на некробактеріоз (фузаріоз) виявляли Fusobacterium necrophorum. Клінічно спостерігали ерозії та виразки спочатку в шкірі міжпальцевого склепіння, вінчика, м’якуша, суглобів, які згодом набували типових ознак гнійно-некротичних вогнищ. Своєрідною клінічною ознакою некробактеріозу на початку розвитку хвороби було утворення чітко виражених грануляційних бар’єрів, які певний час обмежували поширення некротичних змін, але які згодом під дією ферментів і токсинів збудника руйнувались, що зумовлювало прогресування ураження. Некробактеріозні виразки мали рожевий колір, обмаль гнійного ексудату і пальпаторно були досить твердими.
При кератомікозному ураженні захворювання починалось деструктивними змінами копитцевого рогу, вогнища якого прогресували. У зв’язку з цим погіршувались опорні якості рогової капсули, ріг ставав відносно м’яким, він частково розпадався, при пальпації встановлювали болючість. З часом процес ускладнювався явищами неспецифічного гнійного поверхневого пододерматиту.
При мікологічному дослідженні з використанням у складі живильних середовищ часточок копитцевого рогу, що дозволяло встановити кератолітичні властивості патогенів мікозної природи, диференціювали асоціації грибів у різних комбінаціях. Найчастіше виявляли Trichoderma viride, Aeremoniella atra, Cladosporium chrisanthemi.
Результати лікування ураження копитець заразної етіології представлені в табл. 6.
Таблиця 6.
Порівняльна ефективність фенол-скипидар-димексидної емульсії (контроль) та нанокластерного колоїду металів (дослід)
| Показники | Неспецифічні гнійно-некротичні процеси | Некробактеріоз | Кератомікози |
Кількість корів у досліді Кількість корів у контролі |
22 18 |
15 14 |
12 12 |
Кількість обробок, у досліді Кількість обробок, у контролі |
1 – 2 3 – 5 |
2 – 3 6 – 7 |
3 – 4 7 – 8 |
Термін виліковування у досліді, діб Термін виліковування у контролі, діб |
8 – 10 15 – 17 |
10 – 12 16 – 19 |
7 – 9 13 – 16 |
За даними таблиці 6, кількість обробок у досліді, порівняно з контролем, була меншою: а) при неспецифічних гнійно-некротичних процесах у 2,7 разів, б) при некробактеріозі в 2,6 разів, в) при кератомікозному ураженні в 2,1 рази. Термін виліковування в досліді, порівняно з контролем, прискорювався: а) при неспецифічних гнійно-некротичних процесах у 1,8 разів, б) при некробактеріозі в 1,6 рази, в) при кератомікозному ураженні в 1,8 разів.
Таким чином, застосування колоїду наночасток Ag, Cu, Zn, Mg дає змогу значно скоротити кількість лікувальних обробок і суттєво прискорити термін виліковування. Це зумовлено потужною лікувальною дією металів у нанокластерному розмірі, яким, згідно із законами квантової механіки (фізики), притаманна як корпускулярна, так і хвильова активність і які здатні передавати свою енергетику кофакторами металів у всіх без виключення біохімічних процесах, що значно інтенсифікувало перебіг останніх і що знайшло своє вираження в зменшенні лікувальних обробок і прискоренні видужування хворих тварин. При цьому, здійснюючи підбір наноаквахелатів металів, ураховували їхню специфічну участь у процесах обміну речовин. Так, мідь, цинк і магній виступають в якості кофакторів великої кількості біохімічних і структурних процесів: мідь є невід’ємною складовою частиною оксидаз, забезпечує перебіг процесів кератинізації твердих кератинів копит, сприяє антиоксидантному захисту, посилює продукування колагену тощо; цинк, як кофактор біохімічних і структурних перетворень, інтенсифікує продукування м’якого кератину шкіри, посилює перебіг ферментативних реакцій та ін.; магній приймає активну участь у синтезі білка, поділі клітин, в енергетичних реакціях, зокрема в продукуванні АТФ-ази тощо.
Особливе значення у боротьбі з бактеріальними та грибковими інфекціями має срібло, якому притаманні виражені антисептичні властивості. Препарати срібла характеризуються широким спектром антимікробної активності щодо грампозитивних і грамнегативних, аеробних та анаеробних, спороутворюючих й аспорогенних бактерій у вигляді монокультур і мікробних асоціацій, включаючи антибіотикостійкі штами. Сполуки срібла проявляють віруцидну та фунгіцидну активність, діють протизапально. Антисептичні властивості срібла помітно посилюються в поєднанні з міддю.
Застосування металів у нанокластерному масштабі значно інтенсифікує їхню лікувальну здатність.
Отже, якщо лікування тварин з інфекційними ураженнями копитець фенол-скипидарно-димексидною емульсією можна вважати сугубо етіотропною терапією, то застосування наноаквахелатів Ag, Cu, Zn, Mg заключає в собі, крім етіотропної, ще й потужну патогенетичну терапію, що й визначає оптимальний спосіб лікування.
Таким чином, лікування неспецифічних гнійно-некротичних процесів, некробактеріозу та кератомікозів фенол-скипидар-димексидною емульсією є сугубо етіотропною терапією.
Застосування при лікуванні неспецифічних гнійно-некротичних процесів, некробактеріозу та кератомікозів суміші колоїдів наноаквахелатів Ag, Cu, Zn, Mg представляє собою потужну комплексну (етіотропну та патогенетичну) терапію, застосування якої супроводжується значним зменшенням кількості обробок і значним прискоренням виліковування хворих тварин.
5. Лікувальна ефективність очних желатинових плівок із наночастками металів
Лікування кон’юнктивітів і кератитів у тварин краплями лікувальних розчинів досить поширено в офтальмологічній практиці, але при даному методі дія лікарських препаратів короткочасна, а їхня концентрація зменшується у зв’язку з розведенням слізною рідиною. Крім того, очні краплі необхідно застосовувати не менше 5–7 разів на день, що небажано. Все це частково знецінює крапельний метод лікування хвороб очей.
Використання очних лікувальних мазей дозволяє зменшити кількість уведень ліків у кон’юнктивальний мішок до 2–3, але при цьому мазь перешкоджає доступу кисню з повітря в тканини кон’юнктиви і рогівки, що вважається певним недоліком даного методу лікування, а також порушує структуру захисної слізної плівки на поверхні епітелію.
Усі згадані лікувальні недоліки можуть бути усунені при застосуванні очних лікувальних плівок, зокрема виготовлених на желатиновій основі.
Очні лікувальні плівки (ОЛП) виготовляли за методом В.І. Завірюхи і В.І. Саєвича. ОЛП виготовляли з харчового желатину, до якого додавали 0,03 % агар-агару і 1 % гліцерину. Желатин заливали дистильованою водою і витримували 1 год. Після набухання желатин розплавляли на водяній бані при температурі 60 о
С. Одночасно в іншій посудині розчиняли агар-агар, змішували його з желатином, охолоджували до температури 40 – 45 о
С, після чого додавали вибрану лікарську речовину. Після розчинення лікарської речовини додавали гліцерин і виготовляли плівки.
Піпеткою на 1 мл суміш накапували по 0,2 мл в одну точку на чисте скло нагріте до 50 о
С, рівномірно вкрите тонким шаром ланоліну (ланолін не окиснюється при зберіганні плівок). Через 24 год маса загусала і з неї формували плівки овальної форми діаметром 2 та 1 см. Плівки, що висохли, знімали зі скла, вміщували у чисті флакони з-під антибіотика і зберігали у темному місці, краще в холодильнику.
Лікувальну ефективність ОЛП трьох видів апробовували на молодняку великої рогатої худоби, хворого на гнійний кон’юнктивокератит, трьох дослідних груп по 15 голів у кожній, підібраних за принципом аналогів. Досліджували плівки із умістом: 1) 3 % тетрацикліну гідрохлориду, 2) 3% ципрофлоксацину, 3) 3 % наночасток Ag, Cu, Zn, Mg, Co.
Бактеріологічним дослідженням за Берджі у якості збудників нагноєння виявлено стафілококи, стрептококи, кишкову та синьогнійну палички, а також протей у різноманітних комбінаціях.
Усі згадані недоліки усуваються, по перше, при застосуванні очних желатинових лікувальних плівок, по друге, введенням до їхнього складу вдало підібраного набору наночасток металів. При цьому желатинова основа плівок, взаємодіючи з протеолітичними ферментами патогенних мікроорганізмів, зменшує кератолітичний ефект останніх.
Це зумовлено
Важливою особливістю мікроелементів є їхня здатність до прооксидантної дії. Унікальну роль у підтриманні прооксидант-оксидазної рівноваги в організмі відіграють метали з перемінною валентністю, в першу чергу таких як мідь. Залежно від елемента-металу, його концентрації, оксигенації та рН середовища, активності інших компонентів антиоксидантного захисту вони виконують роль як активних прооксидантів, так і антиоксидантів. Йони металів перемінної валентності у відновленій формі є обов’язковою умовою для перебігу реакцій у біологічних мембранах за типом «ланцюгової» реакції (передусім залізо і мідь). Одночасно вони приймають участь і в реакції обриву ланцюга, взаємодіючи з радикалами ліпідних перекисів у присутності протона водню. Таким чином можна цілком вірогідно припускати, що мікроелементи, зокрема Сu, Zn, Mg і Co, впливаючи на різноманітні структурно-функціональні клітинні та субклітинні механізми, виступають як фактор посилення неспецифічної резистентності й стійкості організму проти різноманітних уражень, метаболічних порушень і ендотоксикозу.
Наночастки біогенних металів проявляють стимулювальний ефект більш виражено, ніж їхні молекулярні форми. Висока метаболічна активність наноміді, наноцинку, наномагнію і нанокобальту зумовлена наявністю у наночасток корпускулярного, хвильового та квантового ефектів, які потужно впливають на перебіг біохімічних реакцій, посилюючи їхню асиміляційну здатність. Дія наночасток цілком узгоджується із законами квантової фізики щодо поводження часток такого роду в перебігу різних біохімічних процесів. Різноманітні часточки, які знаходяться в розчині або суспензії у формі атомів, електронів і, можливо, в інших дещо менших за розмірами часток, проявляють ті ж самі властивості, які характерні електронам у класичному фізичному аспекті. У перебігу фізико-хімічних реакцій наночасточки виступають у якості потужного донора та діють як сильні стимулятори перебігу фізичних і хімічних явищ. Усе це і призводить до оптимального лікувального ефекту внаслідок поєднання неспецифічної біофізичної активації зі специфічним стимулюванням перебігу біохімічних реакцій (комплексний стимулювально-біологічний ефект Борисевича – Каплуненка – Косінова).
Застосування тетрациклінових плівок при ураженнях кон’юнктиви і рогівки супроводжувалось терапевтичним ефектом у вигляді припинення слизово-гнійного виділення з кон’юнктивальної порожнини, зникнення гіперемії кон’юнктиви, а відновлення прозорості рогівки спостерігали у 45 – 55 % випадків. Клінічне виліковування, залежно від тяжкості захворювання, наставало на 16 – 20-ту добу.
Лікування септичних виразок рогівки очними лікувальними плівками з тетрацикліном у 45 – 50 % випадків було малоефективним. При цьому було також відмічено, що даний препарат гальмує регенерацію рогової оболонки. Найсильніше погіршувалось відновлення переднього епітеліального шару. При цьому строки регенерації рогової оболонки у деяких тварин затримувались до 30 – 45 діб. Крім того у 3 тварин (6 %) спостерігали перехід захворювання у нейротрофічну форму, у 4 (8 %) – перфорацію виразки.
Такі негативні явища були зумовлені двома основними причинами:
а) тетрациклін пригнічує мітоз кератоцитів і кератоепітеліоцитів, що супроводжується вираженим уповільненням регенерації тканин рогівки;
б) мазева основа обмежує доступ кисню і, як наслідок, знижує рівень метаболічних процесів в уражених корнеальних тканинах.
Місцеву подразнюючу дію як реакцію на тетрациклін у вигляді еритеми кон’юнктиви спостерігали у 2 тварин (4 %). Сенсибілізацію різного ступеня інтенсивності виявили у 3 тварин (6 %). Це зумовлено певними токсичними властивостями антибіотика.
Результати лікувальної ефективності апробованих препаратів у складі желатинових ОЛП представлено в таблиці 7.
Таблиця 7
Ефективність лікування гнійних кон’юнктивокератитів
| Очні лікувальні плівки | Тривалість лікування | Вилікувано повністю | Виявилось ускладнень | Втрачено зір |
| Із тетрацикліном | 13,1±0,67 | 9 (60 %) | 4 (26,6 %) | 2 (13,4 %) |
| Із ципрофлоксацином | 10,6±0,41* | 11 (73 %) | 3 (20 %) | 1 (7 %) |
| Із наночастками металів | 7,4±0,29***••• | 14 (93 %) | 1 (7 %) | - |
Примітка: 1. у порівнянні з тетрацикліновими ОЛП – * <0,05; - *** <0,001;
2. у порівнянні з ципрофлоксациновими ОЛП – ••• <0,001.
Тетрациклін – широко вживаний антибіотик, який порушує синтез білків у мікробній клітині і тим самим зумовлює її загибель. В останній час зареєстровані тетрацикліностійкі штами мікроорганізмів. У ряді випадків цей антибіотик зумовлює негативні побічні ефекти.
Ципрофлоксацин – фторхінолоновий антисептик, бактерицидна дія якого здійснюється двома шляхами: блокуванням ДНК-гірази – ключового ферменту бактеріальної клітини, відповідальної за транскрипцію та реплікацію ДНК, і пригніченням продукування РНК. Ципрофлоксацин активний щодо більшості грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів, включаючи синьо гнійну паличку, хламідії, мікоплазми. За останні 10 років, на протязі яких застосовується ципрофлоксацин, відмічено утворення резистентних штамів мікроорганізмів.
Наночастки металів володіють вираженою антисептичною активністю по відношенню до бактерій, грибів і вірусів. Крім того вони помітно активізують процеси обміну речовин і стимулюють регенерацію.
Важливим елементом терапевтичної дії ОЛП є їхня желатинова основа. Взаємодіючи з протеолітичними ферментами мікроорганізмів за типом субстрат-фермент, вона зменшує патогенетичний ефект протеолітичної дії бактерій на клітини і тканини ока.
Очні желатинові плівки з наноаквахелатами металів за лікувальною активністю в 1,5–2 рази перевищують ефективність таких самих плівок з антибіотиками.
6. Дезінвазія тваринницьких приміщень аніоноподібними наночастками металів
Прогнозовану тривалість вогнищ інвазії визначає здатність збудників паразитозів тривалий час зберігати життєздатність у навколишньому середовищі, досягати інвазійної стадії та спричинювати зараження тварин. Яйця і личинки гельмінтів мають високу стійкість проти впливу факторів довкілля (перепади температури, висушування тощо). Деякі збудники здатні зберігатись у навколишньому середовищі протягом декількох місяців і навіть років. У цьому відношенні особливу увагу привертають яйця та личинки нематод із підряду Ascaridata, які відносяться до групи високостійких.
У результаті лабораторних досліджень на чистій культурі яєць A. suum встановлено:
1. Наночастки срібла, міді, цинку, магнію та олова проявляють чітко виражену овоцидну дію на яйця A. suum незалежно від стадії ембріонального розвитку зародка;
2. Вони взаємодіють лише з живими яйцями нематод, вибірково «налипаючи» лише на них, що зумовлює ефективну овоцидну дію препарату у відносно малих концентраціях;
3. Наночастки срібла, міді, цинку, магнію та олова повністю зберігають овоцидні властивості при їхньому повторному використанні.
Отримані in vitro результати дозволили ствердно говорити про можливості практичного застосування наночасток олова в якості ефективного дезінвазійного засобу.
Відомо, що хімічні речовини ефективні при дії на чисту культуру збудника і нерідко значно знижують свою активність при дослідженні їхньої дії у виробничих умовах. У кожному конкретному випадку залежно від технології утримання тварин і сукупності природних факторів, можуть проявлятися непередбачувані ефекти, що негативно впливають на прояв знезаражуючої дії засобу.
Для об’єктивної оцінки продуктів нанотехнології як дезінвазійного засобу, слід випробувати його у виробничих умовах.
На свинофермі виробничого підрозділу Національного університету біоресурсів і природокористування України «Великоснітинське НДІ імені О.В. Музиченка» було проведено гельмінтокопроскопічне дослідження поросят групи дорощування 2-4 місячного віку та санітарно-паразитологічні дослідження приміщення для їх утримання.
За результатами гельмінтокопроскопічного дослідження було встановлено інвазованість поголів’я свиней збудниками: Trichuris suis, Ascaris suum, Oesophagostomum dentatum та Eimeria suis.
У свиней відмічали відставання у рості та розвитку, розлад травлення, блідість слизових оболонок.
Ступінь зараженості тварин відображено у табл.8.
Таблиця 8
Результати копроскопічного дослідження, М±m, n=40
| Вид збудника | Копроскопічні дослідження | |
| ЕІ,% | ІІ, екз. | |
| Trichuris suis | 57,5 | 7,2±0,3 |
| Ascaris suum | 2,5 | 1,4±0,1 |
| Oesophagostomum dentatum | 17,0 | 6,3±0,2 |
| Eimeria suis | 87,5 | 8,7±0,5 |
З’ясовано, що за три тижні до початку експерименту тварин дегельмінтизували антгельмінтним засобом альбендазол (виробник Укрзооветпромпостач). Препарат задавали з кормом груповим методом у дозі 10 мг/кг.
Як свідчать дані табл. 8, після проведення дегельмінтизації тварини продовжували виділяти у довкілля інвазійні елементи. Серед досліджених тварин переважна більшість були одночасно інвазовані двома та трьома збудниками паразитарних хвороб. А саме, змішану еймеріозно-езофагостомозну інвазію виявляли у 17,5 % тварин, еймеріозно-трихурозну – у 20, аскарозно-трихурозну – у 5, езофагостомозно-трихурозну – у 25 % випадків. У 7,5 % свиней виявили лише один вид збудника паразитарної хвороби. У 30 % тварин зафіксовано міксінвазію, що включала збудники T. suis, O. dentatum та E. suis.
Для проведення досліду було сформовано три дослідні та одну контрольну групи по 10 голів у кожній. Тварин утримували у станках площею 20 м2
, без вигулу. Стіни цегляні, покриті штукатуркою, що подекуди відпала. Цементна підлога, частково покрита дерев’яними дошками, решітки станків і годівниці металеві, вода подається через автонапувалки.
Технологічні процеси прибирання гною, годівлі здійснювали вручну. Стіни та решітки забруднені. Приміщення потребує ремонту.
За результатами санітарно-паразитологічного дослідження встановлено, що яйцями паразитів контаміновані всі досліджувані об’єкти.
Відбір проб для санітарно-паразитологічного дослідження об’єктів навколишнього середовища, де утримувались свині, а саме: зскрібків із годівниць, напувалок, підлоги та стін станків, металевих решіток, проводили за методом А. І. Корчагіна. Із кожного станка відбирали не менше трьох зразків кожного виду. Скальпелем і шпателем відбирали проби масою 10 – 15 г через 1 метр між місцями відбору по діагоналі кліток. Кожну пробу вміщували в стакан і доливали по 20 см3
насиченого розчину кухонної солі. Плівку, що утворювалась після годинної експозиції, досліджували на наявність збудників паразитарних хвороб.
У пробах, відібраних із підлоги, виявлено яйця A. suum в середньому 0,4 екз./г, O. dentatum – 1,1 екз./г. У зішкрібах із поверхні стін було виявлено T. suis – 1,3 екз./г, E. suis – 4,3 та личинки стронгілідного типу – 1,8 екз./г. У годівницях та на поверхні автонапувалок виявлено лише личинки езофагостом у середньому 1,3 екз./г та 0,9 екз./г відповідно. У зіскрібах із шкіри тварин виявлено яйця езофагостом і трихурисів із середнім вмістом зародків нематод 0,8 екз./г та 1,2 екз./г відповідно.
Перед початком дезінвазії було проведено механічне очищення кожного станка. Обробку проводили у присутності тварин методом зрошення. Розрахунок робочого розчину становив 1 дм3
на 1 м2
площі станка. Для дезінвазії використовували аніоноподібні карботовані наночастки магнію. Концентрація наночасток колоїдного розчину знаходилась у межах 100 мг/дм3
.
Перший станок обробляли аніоноподібними наноаквахелатами магнію, другий (контрольний) станок зрошували водою. Через 7 діб після обробки відбирали проби для проведення санітарно-паразитологічного контролю ефективності дезінвазії.
Протягом наступних 3 діб вели спостереження за поведінкою та самопочуттям дослідних тварин.
За результатами санітарно-паразитологічного дослідження після проведення дезінвазії були отримані наступні результати.
У зіскрібках із годівниць були виявлені яйця езофагостом у кількості 18,7 екземплярів у 1 г зскрібка. Причому всі виявлені зародки нематод були нежиттєздатними. Візуально відмічали зміну кольору зародків із світло-сірого до темно-сірого із блискучою оболонкою, з чітко вираженими деструктивними змінами всередині яйця. Плазма всередині яєць набула темного забарвлення, а у деяких екземплярах зародків нематод чітко видно зморщування бластомерів і зміщення їх до одного із полюсів.
У зіскрібках із напувалок і стін також були виявлені поодинокі екземпляри яєць езофагостом свиней у кожній із дослідних груп. Слід відмітити, що жодної личинки виявлено не було, що свідчить про овоцидну дію наночасток металів і припинення їхнього розвитку до стадії личинки.
У зішкребках з підлоги, першого станків, також були виявлені яйця T. suis в середньому 4 екз./1г та ооцисти E. suis. – 7,3 екз./1г, які виявились нежиттєздатними.
У зіскрібках із інших об’єктів довкілля збудників паразитарних хвороб тварин не виявлено.
У контрольному станку об’єкти довкілля були контаміновані яйцями та личинками езофагостом – 4,3 екз./г, яйцями трихурисів – 0,7 екз./г та ооцистами еймерій – 2,3 екз./г. Найбільш забрудненою інвазійними елементами була підлога, в 1 г проби виявляли близько 7 яєць езофагостом, 3 ооцисти еймерій та 1 яйце трихурисів. Їхню життєздатність перевіряли, використовуючи метод седиментації наночасток на поверхню життєздатних яєць. Життєздатних інвазійних елементів не виявлено.
Таким чином, у об’єктах довкілля дослідних груп після проведення дезінвазії не виявлено життєздатних яєць і личинок нематод та ооцист еймерій. Електрично заряджені наночастки металів створюють умови для постійного знезараження життєздатних інвазійних елементів, які виділяють хворі тварини, що сприяє підвищенню рентабельності методу за рахунок економії дезінвазійної речовини.
7. Дезінвазія грунту наночастками магнію
За ступенем екологічної небезпеки для ґрунту магній відносять до класу мало небезпечних елементів, а його гранично допустима концентрація (ГДК) знаходиться в межах від 1000 до 1600 мг/кг. Тому було вирішено дослідження із встановлення дезінвазійних властивостей наночасток проводити із наномагнієм.
Вивчення овоцидного ефекту проводили з використанням водної суспензії гідратованих і карботованих наночасток магнію із вмістом металу 200 мг/дм3
.
Із п’яти зразків ґрунту було сформовано 5 дослідних і 5 контрольних груп по 3 тест-об’єкта у кожній.
Експерименти проводили із ґрунтами наступних типів:
· зразок №1: біогумус, виготовлений шляхом переробки гною великої рогатої худоби та інших органічних відходів за допомогою промислової популяції червоних каліфорнійських червів із додаванням природних структуруючих компонентів; рН 6,0;
· зразок №2: торф – 20%, пісок – 5, перегній – 50, чорнозем – 20, січка з прілої соломи – 5%; рН 7,5;
· зразок №3: ґрунт на основі суміші торфів різного ступеня розкладу з додаванням макро- і мікроелементів; рН 5,5;
· зразок №4: чорнозем звичайний; рН 5,8;
· зразок №5: лісовий ґрунт (сосновий ліс, с. Конча-Заспа); рН 6,0.
До тест-об’єктів вносили культуру яєць із розрахунку не менше 1000 на 1 г ґрунту. Потім їх переносили у мішечки з бавовняної тканини та вміщували у товщу ґрунту того ж типу, із якого сформовано тест-об’єкт.
У процесі експерименту ящики з контейнерами, що містили життєздатні інвазійні яйця аскариди свиней, зрошували нанорозчином магнію (у концентрації 200 мг/л) із розрахунку 1 л на 1 м2
. Контрольні варіанти зрошували водою.
Визначення дезінвазійної ефективності колоїду наноаквахелату магнію проводили через 5 діб від початку експерименту.
Після відмивання яйця нематод вивчали під мікроскопом і культивували у термостаті протягом 20 діб для визначення їхньої життєздатності.
Рис. 4. Ефективність наночасток магнію при дезінвазії ґрунтів різних типів, % 1.
Ряд 1 – біогумус, виготовлений шляхом переробки гною великої рогатої худоби та інших органічних відходів за допомогою промислової популяції червоних каліфорнійських червів із додаванням природних структуруючих компонентів; рН 6,0; Ряд 2 – зразок №2: торф – 20%, пісок – 5, перегній – 50, чорнозем – 20, січка з прілої соломи – 5 %; Ряд 3 – ґрунт на основі суміші торфів різного ступеня розкладу з додаванням макро- і мікроелементів; рН 5,5; Ряд 4 – чорнозем звичайний; Ряд 5 – лісовий ґрунт.
Для ґрунтів різних типів відсоток смертності зародків нематоди варіював у межах 90,4–99,2 %. Яйця аскарид, вилучені із ґрунту контрольних груп, виявилися життєздатними в середньому на 97,2 % (рис.4).
Важливу роль у ступені прояву овоцидної дії наночасток магнію, на нашу думку, відіграють структура та властивості ґрунту, який знезаражується. При цьому, першочерговим фактором, який впливає на процес дезінвазії є ступінь поглинання та утримання вологи у ґрунті різних типів. Виходячи з цього в подальшому слід звертати увагу на такі характеристики ґрунту, як вологоємність, капілярність і водопроникність.
Найбільший овоцидний ефект (99,2 %) встановлено при знезараженні зразка із високим вмістом гумусу. Такий ґрунт найкраще поглинає вологу та утримує її в своїх порах, що створює сприятливі умови для взаємодії наночасток магнію із яйцем нематоди у його товщі.
Зразки ґрунту, що містили суміш торфів (№3) та ґрунтосуміш (№2), також показали доволі високі результати ефективності – відповідно 98,4 % і 97,6 %. Це, очевидно, зумовлено високою вологоємністю торфу, що входить до складу ґрунтосумішей і його здатністю підіймати воду порами. Із літературних джерел відомо, що у торф’яному ґрунті вода піднімається порами на 4–6 м за 35 днів, що значно більше ніж у ґрунті із значним вмістом піску – до 0,6 м та лісовому – до 2 м.
Найкраще вологу поглинають піщані ґрунти, оскільки у них простір між частками ґрунту найбільший, але ця ж особливість структури не дозволяє їм утримувати вологу. Отже, результат ефективності у 90,4%, отриманий при дослідженні зразка №5, зрозумілий. Колоїд, який містить наночастки, суспендовані у воді, настільки швидко проходить через піщаний ґрунт, що для закріплення наночасток на поверхні яєць нематоди лишається надто мало часу.
У зразках ґрунтів усіх типів кислотність була у межах 5,5–7,5, а рН колоїду наноаквахелатів, що застосовували, – 6,7–6,9, тобто у межах, що суттєво не впливали на активність наночасток.
Отже, результати експериментальних досліджень підтвердили припущення про можливість застосування наночасток магнію для дезінвазії ґрунтів різних типів. Перевагами запропонованої методики є її екологічна чистота, здатність наночасток проникати вглиб ґрунту та специфічність дії (лише на живі зародки нематоди). Обробка колоїдом наночасток магнію із вмістом металів 200 мг/л може бути застосована як профілактичний захід для знезараження ґрунту та як один із способів дезінфекції в зонах інтенсивного накопичення яєць паразитів (місця утримання тварин, вигульні дворики, вольєри тощо).
Виробничі досліди дезінвазії ґрунту були проведені у притулку для бездомних тварин. У досліді було задіяно 30 безпородних собак, яких утримували у вольєрах розміром 50 х 50 м по 15 тварин у кожному.
Перед проведенням досліду зробили клінічний огляд тварин. При цьому звертали увагу на їхній зовнішній вигляд, угодованість, апетит. У тварин спостерігали виснаження, анемічність слизових оболонок, тьмяну та скуйовджену шерсть.
З’ясовано, що двічі на рік тварин дегельмінтизують. Знезараження збудників паразитарних хвороб у довкіллі зводиться лише до механічного очищення вольєрів від залишків їжі та екскрементів собак. Дезінвазія у притулку не проводилася взагалі.
За результатами гельмінтокопроскопічного дослідження встановлено, що паразитофауна собак представлена чотирма видами збудників паразитарних хвороб (табл. 9).
Таблиця 9
Результати копроскопічного дослідження екскрементів собак, М±m, n=30
| Вид збудника | Копроскопічні дослідження | |
| ЕІ,% | ІІ, екз. | |
| Toxocara canis | 73,3 | 4,2±0,2 |
| Toxascaris leonina | 16,7 | 3,6±0,1 |
| Ancylostoma caninum | 6,7 | 1,3±0,1 |
| Echinococcus granulosus | 10,0 | 2,5±0,5 |
Як свідчить табл. 9, в організмі собак паразитують збудники декількох видів. Переважна більшість тварин інвазовані нематодою Toxocara canis.
Оскільки тварини постійно знаходяться у одному вольєрі, харчуються із спільного посуду, існує можливість активної циркуляції збудників паразитарних хвороб.
Об’єктами санітарно-паразитологічного дослідження у місці утримання собак були визначені: ґрунт, зіскріби із металевих сіток, решіток та інвентарю для прибирання вольєрів, мисок для годівлі та напування.
Проби відбирали з усієї площі вольєру за методом конверту. Шпателем з поверхні ґрунту відбирали 5 – 10 наважок по 10 – 20 г кожна. Глибина забору становила 1 – 3 см. Після ретельного перемішування цих наважок формували середню пробу ґрунту масою 100–200 гр. Із кожного вольєра було відібрано по 5 проб ґрунту.
У лабораторні стакани ємністю 250 см3
вміщували 25 г ґрунту, який заливали 3 %-вим розчином NaOH у співвідношенні 1:2. Вміст лабораторних стаканів ретельно перемішували і відстоювали протягом 20 – 30 хв. Надосадову рідину зливали, а осад промивали до отримання прозорої надосадової рідини. До осаду в лабораторний стакан додавали 150 см3
флотаційного розчину (натрію нітрату), ретельно перемішували та залишали на 20-30 хв. Утворену поверхневу плівку переносили на предметне скло за допомогою бактеріологічної петлі та розглядали під малим збільшенням мікроскопа.
Дослідження ґрунту на наявність личинок гельмінтів проводили за методом М.П. Гнєдіної. Вільноживучих нематод диференціювали за методом Корта.
За результатами ово- та ларвоскопії встановлено обсіменіння зародками паразитів об’єктів довкілля. У ґрунті виявлено життєздатні інвазійні елементи у 83,3% випадків, у зіскріби із сіток, ґрат і вольєрів та інвентарю, який використовують при догляді за тваринами, – 16,6, зародки паразитів виявлено у 50 % досліджених проб.
У пробах ґрунту було виявлено яйця токсокар в середньому 2,4 екз./г, токсаскарисів – 0,6, яйця та личинки анкілостом – 0,3, ехінококів – 0,2 екз./г.
У змивах із мисок для годування та напування собак були виявлені яйця токсокар у кількості в середньому 3 яйця, токсокарисів – 1,5 яєць, 1 личинка анкілостом. Яєць ехінококів виявлено не було.
Перед проведенням дезінвазії вольєри були звільнені від тварин. Проведено механічне очищення території; посуд, совки та віники відмочували у мильній воді та очищали.
Один вольєр (дослідний) обробляли колоїдом аніоноподібних наноаквахелатів магнію. Вміст металу становив 200 мг в 1 дм3
. Обробку проводили у безвітряну, суху погоду, методом розпилювання із розрахунку 1 л на 1 м2
. Експозиція становила 5 діб. По закінченню терміну експозиції тварин перевели у вольєри.
Другий вольєр (контроль) був зрошений водою.
Для контролю дезінвазії відбір проб проводили двічі. Перший раз після закінчення терміну експозиції – через 5 діб; другий – через 10 діб від початку експерименту, тобто після п’ятиденного перебування собак у вольєрі, після дезінвазії.
Результати досліджень наведено у табл. 10.
Таблиця 10
Паразитарне забруднення об’єктів довкілля у вольєрах до та після дезінвазії
| Час проведення досліду | Виявлення життєздатних зародків паразитів у об’єктах довкілля, % |
|||||
| ґрунт | зіскреби | змиви | ґрунт | зіскреби | змиви | |
| дослід | контроль | |||||
| До дезінвазії | 73,3 | 8,3 | 100 | 66,7 | 16,7 | 100 |
| Через 5 діб після дезінвазії | 0 | 0 | 0 | 53,3 | 0 | 0 |
| Через 10 діб після дезінвазії | 6,7 | 0 | 77,8 | 73,3 | 0 | 88,9 |
Як видно із табл. 10 протягом 5 діб після проведення дезінвазії у дослідних групах не було виявлено жодного життєздатного зародка паразита.
Після п’ятиденної експозиції у пробах ґрунту дослідного вольєру були виявлені нежиттєздатні яйця токсокар і токсаскарисів у середньому 0,3 та 0,1 екз./г.
У пробах ґрунту контрольного вольєру виявлено життєздатні яйця токсокар в середньому 1,7 екз./г, токсаскарисів – 0,4, личинки анкілостом – 0,1, ехінококів – 0,1 екз./г.
У зіскрібках із сіток і ґрат вольєра і на поверхні посуду та інвентарю обох вольєрів зародків нематод не виявлено.
Після п’ятиденного перебування тварин у вольєрах, у пробах ґрунту контрольної групи виявлено яйця токсокар, токсаскарисів, анкілостом та ехінококів в середньому 1,9; 0,6; 0,2; 0,2 екз./г, відповідно.
У дослідних групах виявлено 0,03 екз./г життєздатних яєць токсокар та 0,04 екз./г яєць токсаскарисів.
У змивах із посуду зафіксовано інтенсивність контамінації збудників паразитів у таких же кількостях, як і до обробки.
У зіскрібках із сіток і ґрат у контрольному та дослідному вольєрі яєць чи личинок паразитів виявлено не було.
Наші спостереження показали, що посуд, який використовують для годівлі тварин є одним із важливих факторів передачі інвазії. Його дезінвазія не представляє труднощів. Єдиною умовою є його регулярне миття.
Отже, наночастки магнію здатні ефективно знезаражувати інвазійні елементи, які постійно надходять у довкілля разом із випорожненнями тварин.
Переважна більшість збудників паразитарних хвороб виділяється у довкілля із екскрементами тварин і людини. Тому, місцем накопичення найбільшої кількості інвазійних елементів у тваринницьких господарствах вважають гній і стічні води.
Видалення, знезараження, зберігання, транспортування та використання гною і стоків повинні здійснюватись із урахуванням вимог охорони довкілля від забруднень і виключення поширення збудників інфекційних та інвазійних хвороб.
8. Застосуванням наночасток металів длядезінвазії каналізаційних стоків
Для знезараження стічних вод ТОВ «Наноматеріали і нанотехнології» було розроблено поліметалеві аквананохелати – структуровані агломерати наночасток різних розмірів і різнорідних металів. На поверхні наночасток із відмінними розмірами виникає електричний розряд, пропорційний їхньому розміру. Електрозаряджені наночастки бактерицидних металів (Mg, Zn, Cu, Ag, Pd, Pt, Au, Ir, Sn та Sb) отримані шляхом диспергування металевих гранул імпульсами електричного струму у воді, де вони накопичуються, утворюючи колоїдний розчин. При цьому наночастки знаходяться між собою в електричному контакті.
Використання наночасток суміші металів підсилює|посилювати| біоцидну дію препарату та розширює спектр його дії за рахунок синергічної дії металів.
Електричний потенціал на поверхні наночасток досягає декількох вольт. При розмірі наночасток 100 нм напруженість електричного поля в ближній зоні наночасток сягає 105
В/см, що значно (на три порядки) перевищує пороговий рівень дезінвазійної здатності електричного поля і призводить до знищення яєць і личинок гельмінтів.
Робота включала три необхідно взаємопов’язаних етапи, із яких два перших можна розглядати як підготовчі. Зокрема, на першому із застосуванням загальноприйнятих гельмінтоовоскопічних методів були отримані життєздатні яйця свинячої аскариди.
На другому етапі було налагоджене лабораторне культивування цих яєць та їхнє диференціювання на життєздатні й нежиттєздатні, незрілі та зрілі.
Третій, основний, етап роботи полягав у створенні експериментальної моделі шляхом компанування інвазійного матеріалу, сирого осаду стічних вод тваринницької ферми та наногальванічних елементів, утворених наночастками біоцидних металів. При цьому напруга електричного поля в ближній зоні електричнозаряджених наночасток сягала 100 000 В/см, а кількість самих наночасток в середовищі становила 1010
– 1012
часток/л. За рахунок броунівського руху наночастки знаходились у безпосередній близькості від яєць гельмінтів, що надзвичайно підвищило ефективність дії препарату.
В експерименті були задіяні 6 дослідних і 2 контрольних групи. У вісім ємностей заливали по 1 л сирого осаду стічних вод тваринницької ферми. Потім до кожної з них вносили по 50 життєздатних яєць свинячої аскариди: у 3 дослідні та 1 контрольну групу – не інвазійні, а в інші 3 дослідні та 1 контрольну – інвазійні яйця нематоди (з личинкою всередині).
Електричнозаряджені наночастки бактерицидних металів (Mg, Zn,Cu, Ag, Pd, Pt, Au, Ir, Sn, Sb) були одержані в лабораторних умовах ерозійно-вибуховим способом за технологією ТОВ «Наноматеріали і нанотехнології».| Загальний вміст металів у нанорідині становив близько 100 мг/дм3
.
Нанорідину вносили з розрахунку 500 мл, 1000 і 3000 мл на 1 м3
осаду. Під час експерименту і перед відбором проб дослідні суміші перемішували. Час експозиції дорівнював 6 год, 12 і 24 год.
Після експозиції яйця аскарид вилучали із дослідних сумішей. Для цього до ємності із стічними водами додавали 0,5 г/см3
міді сульфат і ретельно перемішували. Через 40–50 хв після утворення пластівців і просвітлення стічної води надосадову рідину видаляли піпеткою. Осад переносили у центрифужні пробірки та центрифугували протягом 3 хв при 1000 об/хв. Надосадову рідину видаляли, а до осаду додавали 3 см3
3 %-вого розчину соляної кислоти, під дією якої пластівці розчинялися. Після повторного центрифугування та видалення надосадової рідини у пробірки вносили насичений розчин натрію нітрату до рівня на 2–3 мм нижче від її країв. Після годинної експозиції верхню плівку досліджували на наявність яєць гельмінтів і визначали їхню життєздатність.
Яйця нематод двічі відмивали у дистильованій воді з використанням центрифуги (при 1,5 тис. об./хв, протягом 5 хв) та переглядали у бактеріологічних чашках при малому збільшенні мікроскопа.
Для контролю фізіологічної життєздатності яйця культивували в бактеріологічних чашках із фізіологічним розчином у термостаті при температурі 28 º
С протягом 60 діб. Двічі на тиждень яйця аскарид переглядали під малим і великим збільшеннями мікроскопа. При цьому виявляли деформовані та мертві яйця (розрив оболонки, її прогинання, стан плазми)(табл. 11).
Таблиця 11
Овоцидна ефективність електрично заряджених наночасток біцидних металів на яйця Ascaris suum
Доза нано-речовини, мл/м3
|
Експозиція, год | Неінвзійні яйця | Інвазійні яйця | |||
| кількість яєць, які не досягли інвазійної стадії, % | кількість життєздат-них яєць, % | кількість нежиттє-здатних яєць, % | кількість життє-здатних яєць, % | |||
| без роз-витку, % | з розвит-ком, % | |||||
| 500 | 6 | 62,9 | 31,3 | 5,8 | 65,7 | 34,3 |
| 12 | 78,6 | 19,2 | 2,2 | 70,1 | 29,9 | |
| 24 | 81,8 | 16,5 | 1,7 | 79,2 | 20,8 | |
| 1000 | 6 | 73,4 | 25,4 | 1,2 | 68,6 | 31,4 |
| 12 | 80,8 | 18,6 | 0,6 | 75,6 | 24,4 | |
| 24 | 94,2 | 5,8 | – | 80,4 | 19,6 | |
| 3000 | 6 | 86,4 | 12,6 | 1,0 | 83,9 | 16,1 |
| 12 | 92,3 | 7,7 | – | 90,4 | 9,6 | |
| 24 | 96,7 | 3,3 | – | 93,6 | 6,4 | |
| Контроль | 3,7 | – | 96,3 | 1,8 | 98,2 | |
Як зазначено в таблиці 11, ступінь овоцидного ефекту колоїду наночасток біоцидних металів прямо залежить від концентрації реагенту й тривалості експозиції. Нанорозчин ефективніше діє на яйця аскариди свиней, які ще не досягли інвазійної стадії. Крім того, під час експерименту із неінвазованими яйцями нематод серед них відмічали фізіологічне незавершення розвитку в середньому у 15,9 % випадків.
Найвищий, 100 %-й овоцидний ефект мав місце при дозуванні наноречовини 3000 мл/м3
та експозиції 12 і 24 год, а також при використанні колоїдного розчину у концентрації 1000 мл/м3
з експозицією 24 год. Найменшу овоцидну активність мали аквахелати, застосовані у концентрації 500 млна 1 м3
осаду з експозицією до 6 год – 94,2 %. У контрольній групі 96,3 % неінвазійних яєць розвинулися до інвазійної стадії.
Дещо нижчу ефективність проявляє нанобіокомпозит наночасток металів при дії на зрілі яйця A. suum. Задовільний овоцидний ефект (65,7 –79,2 %) дає застосування наноречовини у дозі 500 мл/ м3
при експозиції відповідно від 6 до 24 год.
При застосуванні 3000 мл нанорідини на 1 м3
стічних вод протягом 24 год вдається досягти майже 93,6 %, а при 12 годинній експозиції – 90,4 % елімінації паразитів, що є високоефективним проявом овоцидної дії. У контрольній групі життєздатність нематод зберігалася на рівні 98,2 %.
Висока овоцидна ефективність пропонованого способу знезараження каналізаційних стоків від збудника аскаридозу, відносна простота й доступність застосування дозволяють рекомендувати його до використання в практиці комунального та сільського господарств. Застосування даного методу дезінвазії дозволить оперативно вирішити проблеми дегельмінтизації та утилізації осаду стічних вод без застосування екологічно небезпечних технологій.
Гній і стічні води часто використовують в якості органічних добрив при вирощуванні сільськогосподарських культур. Неякісне проведення їхньої дезінвазії та порушення санітарно-гігієнічних режимів при заготівлі, транспортуванні й реалізації овочів і фруктів може створювати умови для поширення інвазійних хвороб і зараження ними людини.
Список літератури
1. Семенов Б.С. Болезни пальцев у крупного рогатого скота в промышленных комплексах. – Л.: Колос, 1981. – С. 62 – 88.
2. Черняк С.В. Зміни синовіоцитограми, функціональної активності нейтрофілів і лімфоцитів при асептичних артритах у телят (клініко-експериментальні дослідження): Автореф. дис… канд. вет. наук. – Біла Церква, 1999. – 19 с.
3. Белов А.Д., Лукьяновский В.А. Общая ветеринарная хирургия. – М.: Агропромиздат, 1990. – С. 497 – 552.
4. Загальна ветеринарна хірургія / І.С.Панько, В.М. Власенко, В.Й. Іздепський та ін. – Біла Церква: Вид – воБЦДАУ, 1999. – 207 с.
5. Бурденюк В.Ф., Кузнецов Г.С. Ветеринарная ортопедия. – Л.: Колос, 1976. – С.157 – 168.
6. Клінічна діагностика внутрішніх хороб тварин (ред. В.І. Левченко). – Біла Церква: Вид – во БЦДАУ, 2004. – 608 с.
7. Варданян А.В. Влияние условий содержания на качество копытцевого рога и заболеваемость копытец у коров в молочных комплексах: Автореф. дис… канд. вет. наук. – М., 1984. – 16 с.
8. Хомин Н.М. Біохімічні та біофізичні показники копитцевого рогу корів залежно від рівня забезпеченості мінеральними речовинами // Наук. Вісник Національного аграр. ун – ту. – К., 2004. – Вип. 74. – С. 318 – 322.
9. Хомин Н.М. Біофізичні властивості копитцевого рогу у корів у нормі та при асептичному пододерматиті // Вет. медицина України. – 2004. – № 4. – С.41 – 42.
10. Кулінич С.М. Методи лабораторної діагностики грибкових уражень копитець у корів // Збірник наукових праць Луганського аграрного університету: Ветеринарні науки. – 2007. – № 78/101. – С. 328 – 331.
11. Нанотехнологія у ветеринарній медицині. Посіб. для студ. аграр. закл. освіти І – ІV рівней акредитації / В.Б. Борисович, Б.В. Борисович, В.Г. Каплуненко та ін. – К.: ТОВ «Наноматеріали і нанотехнології», 2009. – 232 с.
12. Волошина Н.О. Петренко О.Ф., Каплуненко В.Г. та ін. Екологічні антисептичні засоби профілактики у свинарстві // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. – Біла Церква, 2008. – Вип. 57. – С. 33-36.
13. Пат. 38138 Україна, МПК А 61 L 2/16. Нанорідина для знешкодження у довкіллі збудників інвазійних хвороб тварин / Волошина Н.О., Каплуненко В.Г., Косінов М. В.; власник Волошина Н.О., Каплуненко В.Г., Косінов М. В. – № 2008 08955; заявл. 08.07.08; опубл. 25.12.08. Бюл. № 24.
14. Волошина Н.О., Гоголь А.В., Сиченко Т.В. Дослідження дії наноматеріалу «шумерське срібло» на збудник аскарозу свиней // Ветеринарна біотехнологія. Бюлетень. – 2008. – №13 (2). – С. 67–70.
15. Патент України на корисну модель № 29854. Висококоординаційний аніоноподібний аквананокомплекс / Каплуненко В.Г., Косинов М.В. – опубл. 25.01.08, Бюл. №2.
16. Романенко Н.А., Падченко И.К., Чебышев Н.В. Санитарная паразитология: (Руководство для врачей). – М.: Медицина, 2000. – 342 с.