Научно-методический центр пищевых инфекций методы частной бактериологии

МЕТОДЫ ЧАСТНОЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Составители:

Д.А. Васильев, А.А. Щербаков,

Л.В.Карпунина С.Н. Золотухин

УДК 619:616

Учебно-методическое пособие по методам частной бактериологии.

Предназначено для студентов факультета ветеринарной медицины специализации ветеринарный врач-бактериолог, врач-ветсанэксперт и студентов факультета биотехнологии специализации технолог.

Составители:

Дмитрий Аркадьевич Васильев, Анатолий Анисимович Щербаков, Лидия Владимировна Карпунина, Сергей Николаевич Золотухин.

Рецензент:

доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией микробиологии ВНИИЗЖ В.С. Русалеев.

Предлагаемое учебно-методическое пособие не может заменить практическую работу в лаборатории кафедры, и это не лабораторный практикум в его классическом понимании, но оно позволит студентам лучше подготовиться к экзаменам как по первому модулю, так и по всему курсу микробиологии. Данное учебно-методическое пособие подготовлено применительно к вузовскому курсу для студентов факультета ветеринарной медицины специализаций ветеринарный врач-бактериолог и ветсанэксперт и для студентов факультета биотехнологии специализации технолог.

Пособие написано заведующим кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ Ульяновской ГСХА, д.б.н., профессором Васильевым Д.А., заведующим кафедрой микробиологии и ВСЭ Саратовского ГАУ, д.б.н., профессором Щербаковым А.А, профессором кафедры микробиологии и ВСЭ Саратовского ГАУ, д.б.н., Карпуниной Л.В, руководителем курса микробиологии Ульяновской ГСХА, доцентом, к.в.н., Золотухиным С.Н.

Составители будут признательны получить отзывы, исправления, дополнения по адресу: 432002, Ульяновск–71, а/я 2683, Д.А. Васильеву.

Предисловие

Методы частной бактериологии являются продолжением первой части, «Методы общей бактериологии», изданной кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА в 1998 году. В отличие от первой части, методология данной нацелена на идентификацию конкретного рода или вида микроорганизмов, играющих роль в инфекционной патологии человека и животных, передающихся людям с пищевыми продуктами. В предлагаемой второй части учебного пособия используются методики, приведенные в первой части, но без конкретного описания. Изучавший курс микробиологии уже должен освоить эти методики, и в дальнейшей своей работе по идентификации бактерий, опираясь на них, проводить работу теми методами, что приведены в данной части учебного пособия.

Методический материал, излагаемый в данном учебном пособии, не является каноническим, инструктивным, нормативно-техническим, что позволило составителям продемонстрировать разнообразие схем исследования и методологических приемов, опирающихся на физиологические и биохимические свойства тех или иных микроорганизмов. К тому же нормативно-технические инструкции зачастую не отражают современную тенденцию лавинообразного появления новых таксонов, расширения тестов бактериологического исследования, позволяющих проводить идентификацию микроорганизмов, что обусловлено расширяющимся спектром бактериальных культур, причисляемых к патогенным или условно-патогенным видам, или появлением новых патогенных биовариантов и штаммов.

«…Также наставлю тебя в причинах и знаках болезней...

Бури, предвестницы зим, не чаще бросаются с моря,

Чем нападают на скот болезни: и не одиночек

Губит коварный недруг, но стадо целое сразу, –

Скот и надежду его и все со старшими племя…

Смерти весь род предала животных домашних и диких,

И отравила пруды, и заразой луга напитала…

Целые толпы зараз предает она смерти и в самых

Стойлах груды валит, гниющих в гнусном распаде

Тел, пока их землей не засыплют и в яму не скроют.

Даже нельзя было кож применять и внутренних вымыть

Чистой водою частей, иль пламенем справится с ними.

Также нельзя было стричь изъеденной грязью и хворью

Шерсти, касаться нельзя никому испорченной волны.

Если же кто надевать пытался лихие одежды,

То пупыри у него горячие, с мерзостным потом

Вдруг возникали на членах зловонных, и через немного

Времени хворую плоть священным огнем разъедало…»

ВЕРГИЛИЙ «Сельские поэмы»

(перевод С.Шервинского)

«…отчего происходят болезни, откуда

Может внезапно прийти и повеять поветрием смертным

Мора нежданного мощь, и людей и стада поражая,

Я объясню. Существует немало семян всевозможных,

Из которых одни животворны,

Но и немало таких, что приводят к болезни и смерти,…»

ТИТ ЛУКРЕЦИЙ КАР «О природе вещей»

(перевод Ф. Петровского).

Введение

Заселившие Землю примерно 4 миллиарда лет назад микроорганизмы и в настоящее время являются самой многочисленной группой живых существ, составляя третье царство, которое по предложению Геккеля (1866) имеет собирательное название – протисты
. В свою очередь, протисты подразделяются на высшие и низшие. Высшие протисты, клетки, которых сходны с животными и растительными клетками, являются эукариотами
. К низшим протистам относятся бактерии (включая и риккетсии) и сине-зеленые водоросли, сильно отличающиеся по строению своих клеток от всех других организмов и имеющие общее название – прокариоты
.

По своему химическому составу все живые существа нашей планеты во многом сходны. Их важнейшими компонентами являются ДНК, РНК, белок. Основная физическая единица живого так же универсальна – это клетка. Однако строение клеток прокариот (бактерий и сине-зеленых водорослей), с одной стороны, и клеток животных и растений (в том числе микроскопически малых) – эукариот, с другой стороны, позволяют говорить о весьма существенных различиях между двумя этими группами.

Прокариотов можно рассматривать как реликтовые формы, сохранившиеся с давних времен, а появление эукариотических форм рассматривают как гигантский скачок в эволюции организмов. Однако микроорганизмы, и, в частности, прокариоты, испытывая непрерывное влияние окружающей среды, пожалуй, как ни одна другая форма жизни, постоянно эволюционируют. Заполняя на планете все сколько-нибудь пригодные для жизни экологические ниши, они проходят отбор на выживание, изменяя свои свойства – фенотипические признаки. В свою очередь, измененные прокариоты (в том числе и патогенные для животных и людей) влияют на эволюционные изменения этих животных и человека, являясь одним из факторов естественного отбора. Создание и развитие научно-техно­ло­ги­ческой цивилизации позволяет человеку в какой-то степени влиять на данный фактор эволюционного процесса, сдерживая, а в некоторых случаях и ликвидируя те или иные причины естественного, биологического отбора. Инфекционная микробиология
, изучающая микроорганизмы патогенные или условно-патогенные для человека и животных, и является тем инструментом, что позволяет сдерживать или ликвидировать некоторые причины биологического отбора. Одной из задач инфекционной микробиологии является установление наиболее оптимальных схем и методов идентификации бактерий, изучение их биологических свойств, разработка способов быстрого типирования инфекционного агента. Для искомой типизации можно использовать различные способы: серологические (РА, РСК, РНГА, РДП и т.п.), иммуноаналитические (ИФА, РИА, ФИА и т.п.), генетические (ДНК-ДНК гибридизация, ПЦР и др.), но в любом случае первоначальные исследования по выявлению инфекционного агента и его идентификации будут чисто бактериологическими. Опираться эти исследования должны на фенотипические признаки, характерные для того или иного рода, вида, биотипа бактерий. В предлагаемом учебном пособии приводятся наиболее характерные из доступных для исследований бактериологические тесты, а также фенотипические признаки патогенных и условно-патогенных бактерий. Для описания более детальных исследовательских тестов, направленных на изучение таксономического положения бактерий в систематике, их номенклатуры, существует специальная литература.

Бактерии рода Bacillus

Прямые палочки до 10 мкм, с закругленными или обрубленными концами, часто в парах или цепочках. Подвижные (кроме В. anthracis) за счет перитрихиальных жгутиков. Образуют эндоспоры, характеризующиеся повышенным коэффициентом светопреломления, устойчивостью к повреждающим агентам и высоким содержанием дипиколиновой кислоты (5-20% сухой массы). Клетка-спорангий образует одну эндоспору. Род включает 48 видов; некоторые виды — строгие аэробы, другие — факультативные анаэробы. Возможно изменение окрашивания по Граму, но на ранних стадиях роста бактерии грамположительны. Хемогетеротрофы, метаболизм строго дыхательный или дыхательный и бродильный одновременно (редко строго бродильный); большинство видов образуют каталазу. Род Bacillus содержит несколько патогенных для человека видов (табл. 1); типовой вид — Bacillus subtilis.

Таблица 1. Поражения, вызываемые различными видами рода Bacillus

Поражение	Возбудитель	Образцы для исследования
Сибирская язва	В. anthracis	Отделяемое из очагов поражения*, кровь, СМЖ, сыворотка (для серологии)
Бактериемии , септицемии	В. alvei, В. cereus, В. megaterium, В. pumilus, В. sphaericus, В. subtilis	Кровь
Менингиты	В. alvei, В. circulans, В. megaterium, В. pumilus, В. sphaericus, В. subtilis	СМЖ
Глазные инфекции**	В. brevis, В. cereus, В. coagulans, В. subtilis, В. thuringiensis	Биоптаты роговицы и стекловидного тела
Пневмонии	В. cereus, В. sphaericus, В. subtilis	Мокрота, промывная жидкость бронхов, биоптаты легочной ткани, плевральная жидкость (при наличии)
Эндокардиты	В. cereus, В. subtilis	Кровь
Пищевые токсикоинфекции	В. cereus, В. megaterium	Подозрительная пища (25-50 г), Испражнения, рвотные массы***.

* — один образец для выделения и один для микроскопии.

** — включают язвы роговицы, эндофтальмиты, кератиты, иридоциклиты, панофтальмиты и абсцессы глазницы.

*** — следует определить количественные соотношения с прочими бактериями.

Bacillus anthracis

Возбудитель сибирской язвы у человека и животных. Заболевание известно с глубокой древности, со времен Гиппократа и Гомера, Галена, Цельса и Вергилия болезнь фигурирует под названием «священный огонь» (ignis sacer) или «персидский огонь» (ignis persicus). Русские врачи Колывано-Воскресенских заводов на Алтае А. Эшке (1758) и Н. Ножевщиков (1762) представили в медицинскую коллегию подробные сведения о данном заболевании, включая клинику, эпидемиологию и связь с аналогичной болезнью у животных. В 1766 году Моран доложил о данной болезни в Академии наук в Париже, что является первой научной работой по сибирской язве за рубежом. В 1769 г. Фурнье выделил сибирскую язву в отдельную нозологическую единицу. С.С. Андриевский, изучавший заболевание во время эпидемии на Урале (1786-1788), дал ему название «сибирская язва», а в 1788 г. путем самозаражения доказал единство этиологии сибирской язвы у людей и животных. Возбудитель впервые описали Поллендер, Брауэлл (1849) и Давэн (1850). Чистую культуру возбудителя описал профессор Дерптского русского ветеринарного училища Ф. Брауэль (1857-1858). В своих опытах ему удалось заразить различных животных. Кох (1876) предложил питательные среды для размножения данных микроорганизмов, а в 1881г. Пастер предложил живую вакцину для иммунопрофилактики заболевания. В связи с монополизацией ее производства Пастеровским обществом, Л.С. Ценковский независимо создал отечественную живую вакцину. В 1902 г. Асколи разработал диагностическую реакцию преципитации, широко используемую на практике.

Распространение

Сибирская язва — типичный зооантропоноз; среди животных наиболее восприимчивы травоядные, но отмечены случаи заболевания среди зайцев, кошек и собак; у человека носит выраженный профессиональный характер (сельскохозяйственные рабочие, работники боен, шерстобиты и щеточники). Наиболее интенсивные очаги заболевания находятся в Азии (Турция, Иран, Китай, Монголия, Индия), Южной Африке, Южной Аме­рике (Аргентина) и Австралии; спорадические случаи регистрируют в Европе, России и США. Ежегодно сибирской язвой заболевает около 1 млн. животных и регистрируется около 40 тыс. случаев заболевания у людей.

Животные заражаются при заглатывании спор во время выпаса или при поедании загряз­ненных кормов. У животных преобладают ангинозная, карбункулезная, кишечная и септическая формы заболевания, т.е. возбудитель проникает через микротравмы ротовой полости или стенку кишечника. Больные животные выделяют сибиреязвенные палочки с мочой и испражнениями. Бо­лезнь быстро прогрессирует в течение 2-3 суток, а при молниеносных формах – в течение нескольких часов; летальность достигает 80%. Клинические признаки болезни (судороги, диарея с кровью) проявляются непосредственно перед гибелью животного.

Человек заражается при контакте с инфицированным материалом (уход за больными животными, переработка шерсти, шкур, щетины, кож и костей), либо при употреблении в пищу мяса больных животных. Пути заражения — ингаляция, заглатывание или проник­новение через порезы и ссадины кожи спор Bacillus anthracis. Различают профессиональ­ные (сельскохозяйственные, промышленные) и непрофессиональные (бытовые, случай­ные) группы заболевания. Ежегодно в мире регистрируют 25-100 тыс. случаев заражения.

Значительную эпидемическую опасность представляют скотомогильники, особенно если трупы животных, павших от сибирской язвы, были зарыты без надлежащих предо­сторожностей.

В сельских районах заболеваемость носит сезонный характер, пик заболеваемости прихо­дится на летние месяцы.

Морфология возбудителя

Крупная толстая палочка (5-10´1-2 мкм) с закругленными концами (при образовании цепочек — с обрезанными под прямым углом концами); неподвижна (абсолютный дифференциально-диагностический признак); легко окрашивается по Граму (грамположительна) и анилиновыми красителями. В клиническом материале располагается парами или в виде коротких цепочек, окруженных общей капсулой; на питательных средах образует более длинные цепочки; при этом морфология палочек несколько изменяется — они слегка утолщены на концах и образуют сочленения («бамбуковая трость»). Подобные морфологические изменения еще более явно проявляются при температурной фиксации для окрашивания по Граму. Обработка культур пенициллином приводит к разрушению клеточных стенок и образованию цепочек, состоящих из протопластов («жемчужное ожерелье»). Для защиты от факторов резистентности (фагоцитов, AT) образуют капсулы, наблюдаемые только у бактерий, обитающих в живых организмах либо на средах, содержащих нативную сыворотку (например, среда ГКИ). Капсулы более устойчивы к действию гнилостной микрофлоры, чем микробные тела, и в материале из разложившихся трупов нередко можно обнаружить лишь пустые капсулы («тени» микробов). Для более быстрого обнаружения капсул можно окрасить мазки полихромным метиленовым синим Леффлера (клетки синие, капсулы красно-малиновые). Образуют центрально расположенные эндоспоры, для чего необходимы кислород и определенная температура (12-42°С); в живом организме спор не образуют; также не образуют спор в невскрытых трупах, что обусловлено поглощением свободного кислорода в процессе гниения. Споры отличает высокая устойчивость к внешним воздействиям; в воде они сохраняются до 10 лет, в почве — до 30 лет (возможно и дольше).

Культуральные свойства

Рост. Bacillus anthracis хорошо растет на обычных питательных средах: бактерии можно даже выращивать на сыром или вареном картофеле, настое соломы, экстрактах злаков и бобовых. Температурный оптимум на агаре 35-36°С, на бульоне 32-33°С, оптимум рН 7,0. На жидких средах растет в виде ватных хлопьев, взвешенных комков, не вызывает помутнения среды. Дает характерный рост при посеве уколом в желатин («перевернутая елочка»); позднее верхний слой желатина разжижается, образуя воронку. На твердых средах образует крупные шероховатые серовато-белые колонии (R-формы) диаметром 2-3 мм, типичными считают характерные волокнистые колонии («голова Медузы» или «львиная грива»), образованные переплетающимися цепочками бактерий. Рост вирулентных штаммов на плотных средах и желатине настолько характерен, что может служить диагностическим признаком. На свернувшейся (30 минут при 80°С) лошадиной сыворотке растет в виде гладких прозрачных S-колоний, тянущихся за петлей.

Потребность в кислороде. Палочка сибирской язвы — аэроб или факультативный анаэроб; в анаэробных условиях (либо при значительном варьировании температурного режима) образует мелкие единичные колонии. При культивировании в микроаэрофильных условиях всегда образует гладкие (S), слизистые (М) или смешанные (SM) колонии.

Спорообразование. Споры Bacillus anthracis овальной формы, размером 0,8-1,0 ´ 1,5 мкм; сильно преломляют свет. Они очень легко образуются на бедных питательных средах, а при свободном доступе кислорода — даже в дистилляте или нефиксированных мазках (последнее следует иметь в виду при работе с вирулентными штаммами). На плотных средах спорообразование идет быстрее, чем на жидких; через 32-48 ч при 37°С оно бывает практически полным. Прекращается полностью при 15°С и 42-43°С. Скорость прорастания зависит от температуры (оптимум 37°С) и возраста спор; молодые споры в оптимальных условиях прорастают за 1-1,5 ч, старые – за 2-10 ч.

Биохимия. Возбудитель образует кислоту без газа на средах с глюкозой, фруктозой, маль­тозой и декстрином. Слабое или отсроченное образование газа наблюдают на средах с гли­церином и салицином (не у всех штаммов). Кислотообразования не находят на средах с арабинозой, рамнозой, маннозой, галактозой, раффинозой, лактозой, инсулином, маннитом, дульцитом, сорбитом и инозитом. Гидролизует крахмал; образует ацетилметилкарбинол и лецитиназу. Bacillus anthracis очень медленно и слабо коагулирует жидкую желточную сре­ду; нередко изоляты вообще лишены такой способности. Положительный результат можно ожидать не ранее 5-7 сут. инкубирования при 37°С; в то же время сапрофитные бациллы разлагают ее за 6-10 ч. В отличие от сапрофитов, палочки сибирской язвы лишены фосфатазы и не разлагают фосфаты, содержащиеся в питательной среде. Молоко свертывают за 3-5 сут.; затем сгусток медленно пептонизируется и разжижается; выделяется аммиак и (в связи с окислением тирозина) накапливается бурый пигмент.

Антигенная структура. Выделяют 3 группы основных антигенов (Аг) Bacillus anthracis, 2 из которых (капсульные Аг и токсин) кодируются плазмидами; отсутствие одной или обеих делает бак­терии авирулентными.

Капсульные Аг заметно отличаются по химической структуре от прочих капсулярных Аг бактерий; представлены полипептидами, соединенными с молекулами D-глутаминовой кислоты. По антигенным свойствам выделяют один серотип. AT к капсульным Аг не проявляют защитное действие.

Соматические Аг представлены полисахаридами клеточной стенки; состоят из D-галактозы и N-ацетилглюкозамина в эквимолярных соотношениях; перекрестно реагируют с AT к капсульному полисахариду пневмококков типа 14; введение Аг вызывает синтез AT, не проявляющих защитное действие.

Токсин обычно образуют in vivo (можно выделить из плевральных и перитонеальных экссудатов зараженных животных); in vitro образование токсина можно индуцировать культивированием на средах, содержащих сыворотку; пик образования приходится на18-20 ч инкубирования.

Токсин имеет сложную структуру: включает протективный Аг (взаимодействует мембранами клеток и опосредует проявление активности других компонентов); летальный фактор (проявляет цитотоксический эффект и вызывает отек легких) и отечный фактор (проявляет эффект кальмодулиннезависимой аденилатциклазы, повышает концентрацию цАМФ, вызывает развитие отеков); эти компоненты по отдельности не способны проявлять токсическое действие. Структуры компонентов токсина представлены белками или липопротеинами; их молекулы термолабильны, серологически дифференцируемы и иммуногенны.

Патогенность Bacillus anthracis прямо зависит от капсуло- и токсинообразования; штаммы, не проявляющие подобные свойства, обычно авирулентны.

Капсула защищает бактерии от действия вне- и внутриклеточных продуктов фагоцитов и препятствует поглощению бактерий; на начальных этапах заболевания капсула — важнейший фактор вирулентности. Способностью к капсулообразованию также обладают некоторые вакцинные штаммы (например, Пастера или второй вакцинный штамм Ценковского).

Токсин опосредует проявление признаков и симптомов сибирской язвы. Аккумуляция токсина в тканях и его воздействие на ЦНС приводят к летальному исходу на фоне легочной недостаточности и гипоксии. Разработаны сибиреязвенные анатоксины, но их структура и механизмы действия изучены не полностью.

Лабораторная диагностика в определенной степени зависит от клинической формы заболевания. Для исследования берут содержимое пустулы, гнойное отделяемое из карбун­кула, кровь, мочу, мокроту, испражнения и рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кусочки органов или целые органы. Все образцы следует помещать в герметичные сосуды и транспортировать закупоренными в опломбированные бок­сы. Анализы предусматривают не только проведение рутинных бактериологических исследований, но и заражение лабораторных животных для оконча­тельного уточнения диагноза.

Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме (рис. 1) с посевом на обычные питательные среды, определением подвижности, окраской по Граму и изучением биохими­ческих особенностей (дифференциально-диагностические признаки Bacillus anthracis и родственных спорообразующих анаэробов представлены в табл. 2 и 3).

Серологические исследования позволяют идентифицировать инфекцию у больных и реконвалесцентов; возбудитель можно выявлять AT, мечеными флюоресцеинами (осо­бенно в смешанных культурах), диффузией в геле, в РСК, РНГА и ИФА.

Кожные пробы (реакция ГЗТ) проводят внутрикожным введением 0,1 мл бактериально­го аллергена (антраксин); применяют для ретроспективной диагностики при эпидемио­логических исследованиях.

Реакция Асколи имеет большое значение, т.к. позволяет идентифицировать возбудитель при отрицательных результатах бактериологических исследований. Однако для прижиз­ненной диагностики она не имеет серьезных преимуществ перед вышеуказанными бакте­риологическими и серологическими методами.

Типирование бактериофагом. Возможно проведение дифференциальной диагности­ки с помощью бактериофагов.

Отличительная особенность возбудителя — высокая чувствительность к пеницил­лину; выращивание на средах, содержащих пенициллин, приводит к проявлению фено­мена «жемчужного ожерелья».

Биологическая проба. Заражение подопытных животных проводят одномоментно с посевом на питательные среды. Материал можно вводить белым мышам (по 0,1-0,2 мл в спину), кроликам и морским свинкам (по 0,2-0,5 мл в область живота). Обычно мыши погибают через 1-2 суток, морские свинки и кролики — через 2-4 суток. Наблюдение продолжают в течение 10 дней. У павших животных обычно исследуют печень, селезенку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца, места введения заразного материала. Делают посевы на питательные среды.

Профилактика

Иммунизация. Для профилактики зоонозов иммунизируют животных живой вакциной, приготовленной из некапсулированного штамма Bacillus anthracis, или протективным Аг.

Таблица 2. Морфология, особенности роста и патогенность В. anthracis и родственных спорообразующих анаэробов

Признак	В. an th racis	В . cereus	В . subtilis	В . mesentericus В . pumilus	В . megaterium	В . mycoides
Капсулообразование в атмосфере с повышенным содержани­ем СО2	+	–	–	–	–	–
Подвижность (висячая капля)	–	+	+	+	+	+
Гемолиз ЭБ	–	+	–	±	–	+
Рост на жидких средах:
на бульоне	Среда с осадком (хлопьевидным), про­зрачная, без пленки, кольцо около стенок легко смывается	Среда мутная, осадок трудноразбиваемый, крошковатый, прочные пленка и пристеночное кольцо	Бульон мутный, при образовании пленки среда просветляется	Бульон остается почти прозрачным, на поверхности среды морщинистая пленка	Помутнение среды, пленки не образует, осадок не­значительный	Помутнения среды нет, на дне ватообразный осадок, пленки не образует
на молоке	Подкисление, свертывание и пептонизация (медленная)	Пептонизация быст­рая, со свертыванием или без него	Подщелачивание, медленная пептониза-ция	Пептонизация мед­ленная, иногда свертывание	Пептонизация	Пептонизация, иногда, может быть без свертывания
на твердых средах:
на агаре	Серо-белые, как пу­шинки, колонии, при увеличении вид «львиной гривы»	Колонии белые, твердые, круглые, иногда окрашенные в желтоватый цвет, по краям извитые нити	Колонии белые или сероватые, ползущие на стенку пробирки, в конденсатной воде пленка	Толстый матово-белый морщинистый налет, образует пленку в конденсатной воде	Колонии слизистые, желтовато-белые, темнеют при наличии тирозина в среде	Войлоковидные нало­жения, ползущие по поверхности среды
на желатине	Медленное разжиже­ние, образует фигуру «перевернутой елочки»	Разжижение быстрое и сильное, вдоль укола образует гори­зонтальные отростки	Колония окружена венком из отростков, на поверхности раз­жиженного желатина образует пленку	Колонии круглые, разжижение медлен­ное	Медленное воронко­образное разжижение	Быстрое разжижение
Патогенность:
для мышей	+	+	–	–	–	–
для морских сви­нок и кроликов	+	–	–	–	–	–

ЭБ — эритроциты барана.

Таблица 3. Метаболические особенности В. anthracis и родственных спорообразующих анаэробов

Признак	В. anthracis	В . cereus	В . subtilis	В . mesentericus В . pumilus	B . megateritum	В. mycoides
Лакмусовая сыворотка	Краснеет	Синеет	Синеет	Краснеет	—	—
Ферментация:
Свернутой яичной среды	± (медленно)	+	—	+	—	+
Арабинозы	–	–	+К	+ К	± К	–
Ксилозы	–	–	+К	+К	± К	–
Крахмала	+	+	+	–	+	+
Салицина	± (медленно)	+	Сведений нет	+	Сведений нет	Сведений нет
Восстановление метиленового синего в среде (через 48ч)	–	+	±	–	Сведений нет	–
Образование уреазы	—	±	~	—	±	±
Редукция нитратов	±	±	+	–	±	±
Реакция Фогеса-Проскауэра	+	–т	+	+	—	±
Чувствительность к пенициллину	+	~	—	—	~	—

К — ферментация с образованием кислоты.

Рисунок 1. Принципиальная схема бактериологического выделения

возбудителя си­бирской язвы

Bacillus cereus

Bacillus cereus (от лат. cera — воск, свеча) широко распространена в природе, морфологически сходна с Bacillus anthracis (характерно расположение микробных тел в виде штакетника), но обладает подвижностью, чувствительна к действию g-фага бацилл и гемолизирует эритроциты барана. Вызывает спорадические случаи пищевых отравлений у человека. Температурный оптимум роста 30°С, оптимум рН 7-9,5. На МПА образует «распластанные» колонии с неровными краями; на КА колонии «распластанные», зернистые, с широкой зоной гемолиза, на яичном агаре образует широкую зону преципитации белого цвета (эффект бактериальной лецитиназы), зона быстро растет, и через несколько суток инкубации охватывает всю поверхность чашки. Колонии, выросшие на агаре, имеют характерный восковидный вид. На жидких средах бацилла образует белый хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона. Следует отметить высокую протеолитическую активность микроорганизма — разжижает желатин в течение 1-4 сут (80% штаммов); все штаммы образуют лецитиназу и ацетилметилкарбинол, расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов — также и сахарозу, глицерин, лактозу, галактозу, инулин, дульцит и декстрин.

Bacillus cereus вызывает два типа пищевых отравлений (гастроэнтеритов); интоксикацию опосредует энтеротоксин, образуемый вегетирующими формами, прорастающими из спор устойчивых к определенным термическим режимам обработки пищевых продуктов (обычно овощей). Бациллы образуют токсины только in vivo, во время прорастания спор.

Первый тип отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 ч), характерны изнуряющие диарея и рвота. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсемененной большим количеством микроорганизмов. Часты случаи отравлений в связи с употреблением жареного риса, содержащего проросшие споры Bacillus cereus, эти случаи не менее часто ошибочно связывают с отравлениями стафилококковым энтеротоксином. Подобные отравления можно считать токсикозами (или гнилостной инфекцией), связанными не столько с активностью токсина, сколько с действием метаболитов, накапливающихся в пищевых продуктах.

Второй тип отравлений характеризует более продолжительный инкубационный период (около 17 ч); патогенез полностью опосредован действием энтеротоксина, боль­ные жалуются на схваткообразные боли в животе, диарею; этот комплекс симптомов часто и ошибочно принимают за пищевые отравления, вызванные клостридиями.

Патогенез обоих типов отравления в большей или меньшей степени связан с действием энтеротоксина; механизмы его действия остаются до конца не изученными, но его актив­ность не связана со стимуляцией аденилатциклазы.

Предрасполагающие факторы — различные нарушения иммунитета.

Вторичные иммунодефициты, вызванные применением цитостатиков и иммунодепрессантов, а также различными патологическими состояниями, сопровождаемыми иммунодепрессиями (например, острыми лейкозами), могут быть причиной тяжелых, часто фатальных инфекций Bacillus cereus с массированными бактериемиями, эндокардитами и менингитами.

Применение b-лактамных антибиотиков для подавления роста Bacillus cereus мо­жет вызвать бурный рост резистентных штаммов.

Протезы. Вероятность развития непищевых инфекций также велика у лиц с протезиро­ванными органами, катетерами, а также у пациентов с гемодинамическими нарушениями.

Диагностика

Диагностическим признаком считают обнаружение в подозрительных про­дуктах более 105
бактерий в 1 г/мл продукта либо 102
-103
бактерий в 1 г/мл каловых и рвотных масс или промывных вод.

Прочие виды, имеющие значение

Включают Bacillus subtilis, В. megaterium, В. alvei, В. laterosporus, В. pumilus, В. thuringiensis и В. sphaericus. Два первых вида — широко распространенные сапрофиты, остальные виды — энтомопатогены. Они могут вызвать заболевания человека в составе микробных ассоциатов, особенно у лиц с иммунными расстройствами. Значительная часть героина, продаваемого уличными торговцами, обсемене­на Bacillus sublilis, отсюда тяжелые глазные инфекции и бактериемии у наркоманов. Также следует упомянуть В.stearothermophilus, патогенную для насекомых и применяемую в каче­стве средства биологического воздействия в первую очередь на гусениц чешуекрылых (Lepidiptera). Механизм энтомоцидного действия связан со способностью образовывать белковые кристаллические структуры (гранулы) при спорообразовании, они высвобождаются при про­растании споры и выделяют бактериальные токсины под действием пищеварительных фер­ментов желудочно-кишечного тракта гусеницы.

Питательные среды для культивирования бактерий рода
Bacillus

Среда ГКИ (Шляхов, 1973). К раствору Хенкса добавляют 40% (объем/объем) стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56°С 30 мин. Раствор Хенкса можно заменить бульоном Хоттингера (рН 7,2—7,4). Среду используют для обнаруже­ния способности капсулообразования у В. anthracis.

Среда Томова (Шляхов, 1973). В состав среды входят 50 мл пептонного агара (10%-ный раствор агара, 2,5%-ный раствор пептона, 0,5%-ный раствор натрия хлорида), 100 мл сыворотки крови круп­ного рогатого скота, 50 мл куриного белка, 25 мл 0,4% гемина в 0,01 н растворе натрия гидроксида, 25 мл 0,01 н уксусной кислоты. В стерильной колбе смешивают сыворотку крови, белок, подогревают до 50°С и добавляют к расплавленному пептонному агару, имеющему температуру 50°С. Затем добавляют раствор гемина, уксусную кисло­ту, компоненты перемешивают и стерильно разливают в чашки Петри. На данной среде возбудитель сибирской язвы растет в S-или SM-форме. Среда обладает селективными свойствами: растут В.anthracis, В. cereus, не растут В. subtilis, В. megaterium, В. brevis, В. mycoides.

Среда Knisely (1966). К расплавленному питательному агару до­бавляют 40 мг/мл лизоцима, 30 ЕД/мл полимиксина, 300 мг/мл натри­евой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА), 40 мг/мл таллия ацетата. Растворы предварительно стерилизуют фильтрацией. Устанавливают рН 7,35. Через 24-48 ч инкубирования при 37°С В. an­thracis вырастает в виде мелких, гладких колоний. Другие виды бацилл на этой среде обычно не растут.

Лизоцимовая среда (Claus, Berkeley, 1986). Первоначально готовят раствор лизоцима, содержащий 10000 ЕД/мл в дистиллированной воде, и стерилизуют фильтрацией. 1 мл раствора лизоцима смешивают с 99 мл стерильного питательного бульона и разливают по 2,5 мл в пробирки. При изучении бацилл, патогенных для насекомых, 1 мл лизоцимового раствора (0,1%) смешивают с 99 мл полужидкого агара, который готовят следующим образом. В 1 л дистиллированной воды растворя­ют 10 г агара, 3 г Na2
HPO4
, по 5 г дрожжевого экстракта и триптона; фильтруют, устанавливают рН 7,3-7,5 и стерилизуют при 121°С 20 минут. Затем стерильно добавляют раствор глюкозы из расчета 2 г/л. Глюкозу предварительно стерилизуют в виде 10%-ного раствора при 115°С 20 минут. Используют для идентификации видов рода Bacillus.

Дифференциально-диагностическая среда. К 100 мл питательного агара, расплавленного и имеющего температуру 45—50°С, добавляют следующие растворы: 0,5 мл полимиксина М сульфата, 0,5 мл невиграмона, 1,0 мл гризеофульвина, 10 мл моющего средства «Про­гресс», 0,1 мл натрия фенолфталеинфосфата. Компоненты перемеши­вают, разливают в чашки Петри. Среда пригодна 1—2 суток при хранении в условиях холодильника. Через 18—24 ч культивирования посевов в крышку чашки Петри вносят 1-2 мл 25%-ного водного раствора аммиака. Чашку выдержи­вают (крышкой вниз) при 20°С 1 минуту и учитывают результат. Коло­нии бактерий с фосфатазной активностью розовеют, остальные колонии, в том числе В. anthracis, остаются бесцветными. Среда обладает селектив­ными свойствами.

Приготовление растворов
. Полимиксина М сульфат растворяют в физиологическом растворе с расчетом 10000 ЕД/мл. Невиграмон растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака, затем разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентра­ции 100 мкг/мл. Моющее средство «Прогресс» разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 0,1%. Гризеофульвин расти­рают в ступке, растворяют в стерильной дистиллированной воде до кон­центрации 100 мкг/мл. Натрия фенолфталеинфосфат (коммерческий 10%-ный раствор) прогревают на водяной бане при 56°С 30 минут. Среду используют для выделения из загрязненного материала воз­будителя сибирской язвы.

Среда Буза (Шляхов, 1973). К 3%-ному голодному (без пепто­на) агару (рН 7,2-7,4) добавляют 15% дефибринированной крови барана. Используют для культивирования возбудителя сибирской язвы.

Селективный агар для выделения и идентификации В. cereus (Hoibrook, Anderson, 1980). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 10 г маннита, 2 г натрия хлорида, 0,1 г магния сульфата, 2,5 г Na2
HPO4
, 0,25 г КН2
РО4
, 0,12 г бромтимолового синего, 10 г натрия пирувата, 14 г агара. Стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут. К расплавленному и охлажденному до 50°С агару добавляют стерилизованный фильтрацией раствор полимиксина В на дистиллиро­ванной воде из расчета конечного содержания 100 ЕД в 1 мл среды. Ком­поненты перемешивают и среду разливают в чашки Петри. Типичные колонии В. cereus диаметром около 5 мм с характер­ным синеватым оттенком (расщепление маннита), окружены зоной преципитации желточной эмульсии аналогичного цвета. По этим призна­кам В. cereus можно отличить от других бацилл, кроме В. thuringiensis. Изменение желточного компонента в среде вызывают также S. aureus, S. marcescens, P. vulgans, но они имеют другую форму колоний и зону про­светления вокруг них.

Жидкая среда обогащения для выделения В. cereus (Claus, 1955). В 100 мл дистиллированной воды растворяют 10 г KNO3
, 5 г пепто­на, 3 г мясного экстракта. Устанавливают рН 7,0, стерилизуют при 120°С 15 минут. Исследуемый материал предварительно прогревают при 80°С 10 минут. Через 24 ч инкубирования при 30°С одну бактери­ологическую петлю засевают на питательный агар с желточной эмуль­сией. Культивируют при 37°С для подавления роста В. mycoides.

Бактерии рода Clostridium

К роду Clostridium относятся подвижные палочки (реже неподвижные), величиной 1,5-20,0 мкм, с закругленными, иногда с заостренными концами, часто расположеные в парах или короткими цепочками. Образуют овальные или круглые эндоспоры, придающие клеткам веретенообразную форму (от гр. kloster — вере­тено). С возрастом могут изменять отношение к окрашиванию по Граму, но на ранних стадиях культивирования всегда грамположительны. Большинство видов хемоорганотрофы, но некоторые могут расти хемоавтотрофно или хемолитотрофно; одни виды проявляют сахаролитическую, другие — протеолитическую активность (возможно сочетание этих свойств либо их полное отсутствие). Наиболее характерные признаки — способность вызывать маслянокислое брожение и анаэробный распад углеводов с образованием масляной кислоты и газов (СО2
водород, иногда метан). Восстанавливают сульфиты до сульфидов. Обычно каталазо­отрица­тельные. Большинство видов — строгие анаэробы; также имеются аэротолерантные виды или отдельные штаммы. Типовой вид — Clostridium butyricum; вызывает маслянокислое брожение углеводов, открытие этой палочки позволило Пастеру (1861) выделить анаэробные микроорганизмы. Термин «клостридии» ввел Трекюль (1863). Род включает виды, обитающие в почве, на дне пресных и соленых водоемов, в кишечнике человека и животных; некоторые виды патогенны, а некоторые нашли применение в промышленном производстве некоторых органических кислот и спиртов. Современная систематика выделяет 5 групп микроорганизмов, разделяемых по расположению спор, способности гидролизовать желатин и особым требованиям для роста. По экологическим свойствам выделяют 3 группы клостридий: возбудители бродильных процессов (с преоб­ладанием сахаролитических свойств); возбудители процессов гниения (с преобладанием протеолитических свойств); патогенные виды (могут быть протеолитическими и сахаролитическими) Последнюю группу составляют возбудители травматических клостридиозов (газовой гангрены, столбняка), возбудители энтеральных клостридиозов и непатогенные виды, вызывающие патологические процессы в ассоциациях с другими патогенными клостридиями. Клостридиозы, как правило, имеют экзогенное происхождение. Число видов в роде достигло 100, из них менее 20 выделяют при различных поражениях животных и человека; их основные идентифицирующие признаки представлены в табл. 4.

Clostridium perfringens — один из основных видов рода. Возбудитель злокачественного отека, инфекционной энтеротоксемии животных, анаэробной дизентерии молодняка сельскохозяйственных животных, пищевых токсикоинфекций человека. По способности образовывать 4 главных токсина (a-, b-, e- и i-) микроорганизмы разделяют на 6 сероваров — А, В, С, D, Е и F (представители последнего, по-видимому, принадлежат к типу С). Основной возбудитель заболеваний человека — Clostridium perfringes типа А (С. welchii); при некротических энтеритах иногда выделяют микроорганизмы типов С и F; возбудители типа D вызывают инфекционные энтеротоксемии. Clostridium perfringens типа А открыли американские патологи Уэлч и Нэталл (1892), в чистой культуре получили Вейон и Жубер (1893), давшие ему название perfringens.

Распространение

Микроорганизмы широко распространены в окружающей среде, их выделя­ют из воды, почвы и сточных вод, часто обитают в кишечнике людей и животных; Clostridium perfringes также способны вегетировать в почве, богатой гумусом. Наиболее часто в почве и испражнениях обнаруживают серотип А. Место постоянного обитания представителей серотипа С, ответственных за пищевые токсикоинфекции у человека, пока не установлено, возбудителей выделяют из мясных и рыбных консервов и органов людей, умерших от «некротического энтерита».

Таблица 4. Идентифицирующие признаки патогенных для человека видов рода Clostridium

Вид	Споры	Аэробный рост	Лецитин	Липаза	Желатин (гидролиз)	Индол	Основные продукты метаболизма	Комментарии
С. botulinum:
I группа	ОС	–	–	+	+	–	УК, МК, иМК, иВК
II группа	ОС	–	–	+	+	–	УК, МК
III группа	ОС	–	+	+	+	–	УК, ПК, МК
IV группа	КC	–	–	–	+	–	УК, ПК, МК, иМК, ФУК	Синоним — С. aryentiense
С. tetani	ОС	–	–	–	+	±	УК, МК, ПК	Дает феномен роения на КА
С. perfringens	ОС	–	+	–	+	–	УК, МК	Редко образует споры, дает двойную зону гемолиза на КА неподвижны
С. difficile	ОС	–	–	–	±	–	УК, МК, иМК, ВК, иВК, иКК
С. sordellii	ОС	–	+	–	+	+	УК	Уреаза-положительна
С. novyi A	ОС	–	+	+	+	–	УК, ПК, МК	Особо чувствительна к О2 Дает b-гемолиз
С. novyi В	ОС	–	+	–	+	–	УК, ПК, МК
С. histolyticum	ОС	±	–	–	+	–	УК	Не ферментирует углеводы
С. septicum	ОС	–	–	–	+	–	УК, МК	Дает феномен роения на КА
С. bifermentans	ОС	–	+	–	+	+	УК	Уреаза-отрицательна
С. sporogenes	ОС	–	–	+	+	–	УК, МК, иВК
С. tertium	ОС	+	–	–	–	–	УК, МК
С. ramosum	КС/ОС	–	–	–	–	–	УК	Редко образует споры, часто окрашивается грамотрицательно
С. butyricum	ОС	–	–	–	–	–	УК, МК
С. bryantii	КС/ОС/ТС	–	+	–	–	–	УК, МК, МолК

Примечание. Споры: ОС — овальные; КС — круглые; С — субтерминальные; ТС — терминальные. Метаболиты: УК — уксусная кислота; МК (иМК) — масляная (изомасляная) кислота; ПК — пропионовая кислота; ВК (иВК) — валериановая (изовалериановая) кислота; иКК — изокапроновая кислота; МолК — молочная кислота. КА — кровяной агар

Морфология и культуральные свойства возбудителя

Вегетативные клетки — крупные, строго грамположительные, жгутиков не имеют, неподвижны (один из немногих неподвижных видов). Классические формы представлены короткими палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0 ´ 1-1,5 мкм). Морфология может варьировать (антибиотики, ионы металлов, радиоактивное облуче­ние), например, in vitro на углеводных безбелковых средах могут образовываться коккобациллярные формы, а на белковых безуглеводных средах — нити с заостренными концами длинной до 145 мкм. In vivo образуют капсулы (единственный капсулообразующий вид среди патогенных клостридий). В течение некоторого времени капсулы сохраняются и при культивировании на средах, содержащих нативный белок, наиболее выражены у вирулентных штаммов, резистентных к фагоцитарным реакциям. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в старых культурах могут быть грамотрицательными.

Споры Clostridium perfringens крупные, овальные, расположены центрально (у С. perfringens типа А — также субтерминально), клетка-спорангий практически не деформируется. Тер­моустойчивость спор серотипов В и D относительно невысока (погибают при кипячении в течение 15-30 минут), споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении и даже автоклавировании в течение 1-6 ч. Спорообразование обычно имеет место в почве и кишечнике, in vitro споры можно получить на щелочных средах, богатых белком и не содержащих утилизируемых углеводов (например, на свернувшейся лошадиной сыворотке). Спорообразование стимулирует прогревание при 75°С в течение 10-15 минут.

Тип А. Clostridium perfringens типа А — факультативный анаэроб (в сравнении с другими клостридиями) и относительно толерантен к кратковременным кислородным воздеиствиям, хотя имеются чувствительные штаммы, погибающие при воздействии О2
на культуру в течение 3 минут. Способен расти в высоких столбиках сред без герметизации вазелином.

Морфология колоний

У Clostridium perfringens типа А значительно варьирует от условий выращивания. На плотных питательных средах обычно образуются S- и R-колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями, в начале роста прозрачные, напоминающие капли росы, позднее становятся мутными, серовато-белыми. R-колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями, в глубине агара напоминают комочки ваты. У некоторых штаммов отмечают слизистые М-колонии, особенно у слизистых вариантов С. perfringens типа А, образующих густую слизь на жидких средах, они напоминают S-колонии с более высоким куполом и слизистой консистенцией; представлены капсулированными клетками. Иногда можно наблюдать смешанные О-колонии.

На агаре Цейсслера через 12-18 ч образует гладкие сероватые колонии с ровными краями и плотным возвышением в центре. Колонии окружены зоной гемолиза, он может быть полным либо частичным. Зона гемолиза может быть двойной: вокруг колоний полный гемолиз (за счет действия гемолизинов), на отдалении — неполный (за счет действия лецитиназы). При контакте с кислородом колонии могут приобретать зеленоватую окраску.

На желточном агаре образует колонии, окруженные зоной перламутрового преципитата (фосфорилхолин), образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы.

Характерный признак колоний Clostridium perfringens типа А — способность менять серова­то-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в аэробных условиях (может служить дифференциально диагностическим признаком).

Колонии в толще питательной среды имеют вид чечевичных зерен, дисков или комочков ваты.

Рост на жидких и полужидких средах, особенно содержащих глюкозу, происходит очень бурно с образованием Н2
и СО2
, и обычно заканчивается через 8-12 ч; при стоянии среда постепенно светлеет и образуется обильный осадок, культуры Clostridium perfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. Первые признаки роста на среде Китта-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 ч (особенно при 43°С); последние проявляются появлением пузырьков газа из-под кусочков печени при встряхивании. Помутнение среды и активное газообразование можно наблюдать через 4-8 ч культивирования.

Антигенная структура

Выделяют 6 сероваров (A-F) Clostridium perfringens, различающихся по антигенным свойствам продуцируемых экзотоксинов. Все серовары образуют a-токсин (лецитиназу). Тип А включает много подтипов, идентифицируемых реакциями агглютинации, что облегчает диагностику в случаях пищевых токсикоинфекций и анаэробных раневых инфекций.

Метаболическая активность

Clostridium perfringens расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, раффинозу, маннозу, крахмал, гликоген и инозит; глицерин разлагают не все штаммы, не сбраживает маннит, дульцит; редко ферментирует салицин и инсулин. От прочих клостридий С. perfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая; разжижает желатин, не разлагает казеин; только некоторые штаммы медленно разжижают свернувшуюся сыворотку. Интенсивно створаживают молоко с образованием крупноячеистого губчатого сгустка уже через 3 ч (феномен известен как «штормовая реакция»)

Патогенность

Для человека патогенны Clostridium perfringens типов А, С и D; типы В,С, D и Е вызывают аналогичные заболевания у сельскохозяйственных животных (табл. 5).

Таблица 5. Заболевания, вызываемые С. perfringens

ТИП	Заболевание
A	Газовая гангрена людей и животных, пищевые токсикоинфекции
B	Дизентерия молодняка сельскохозяйственных животных, энтеротоксемия овец и коз
C	Некротический энтерит человека, геморрагическая энтеротоксемия овец, коз, поросят и телят
D	Инфекционная энтеротоксемия человека, овец, коз, кроликов, телят, «травяная болезнь» лошадей
E	Энтеротоксемия телят и ягнят

Токсины и клинические проявления

Токсины. Clostridium perfringens образует как минимум 12 идентифицированных токсинов (ферментов) и энтеротоксин; у гиалуронидазы и дезоксирибонуклеазы (m- и n- токсины) токсичность не доказана; b-, g-, h-, d-, e‑, q- и i-токсины обладают летальным свой­ством, но их биохимическая активность изучена недостаточно, и только a-, k- и l-токсины – ферменты с выраженным токсическим действием. Мишени для действия основных токсинов — биологические мембраны в различных тканях, в основе поражения находятся ферментативные процессы, катализирующие гидролитическое расщепление и нарушение клеточной проницаемости с последующим отеком. Последний сопровождается снижени­ем окислительно-восстановительного потенциала в клетках, активацией эндогенных протеаз, приводящих к аутолизу тканей, характерному для газовой гангрены.

a-Токсин (лецитиназа С) проявляет дерматонекротизирующее, гемолитическое и летальное (убивает лабораторных животных при внутривенном введении) действие, опосредованное лецитиназной (фосфолипазной) активностью (разлагает лецитин на фосфорилхолин и глицериды), продуцируют все типы Clostridium perfringens, но наиболее интенсивно тип А.

b-Токсин вызывает некроз тканей и оказывает летальное действие на морских свинок-альбиносов, гемолитического действия не оказывает, активность in vivo реализуется в развитии некротических энтеритов, основные продуценты — типы В и С.

d-Токсин проявляет гемолитическую активность в отношении эритроцитов барана, но не в отношении эритроцитов кролика или лошади, оказывает летальное действие на лабо­раторных животных, основные продуценты — типы В и С.

q-Токсин оказывает гемолитическое (кислород-чувствительное), дерматонекротизирующее и летальное действие, разрушает эритроциты барана и лошади, а также (незначительно) мыши, основной продуцент — Clostridium perfringens типа С, типы А, В, D и Е образуют его в меньших количествах.

e- и i-токсины оказывают летальное и дерматонекротизирующее действие, протоксины, выявляемые в фильтратах культур, активируются трипсином. e-токсин продуцируют типы В и D, i-токсин — штаммы типа Е.

k-токсин (коллагеназа и желатиназа) разрушает ретикулярную ткань мышц и коллагеновые волокна соединительной ткани, активно усиливает цистеин в присутствии Fe2+
, оказывает летальное и некротизирующее действие, продуценты — типы А, С, Е и некоторые штаммы типа D.

l-токсин (протеиназа) расщепляет денатурированный коллаген и желатин, во многом действует подобно фибринолизину, как и e-токсин, секретируется в форме протоксина, активируемого трипсином. Проявляет активность экзоэнзима, обусловливающего некротические свойства.

g-и h-токсины оказывают летальное действие на лабораторных животных; их биохимическая природа остается неизвестной.

m- и n-токсины по своей химической природе — гиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза, m-токсин ответствен за повышение проницаемости тканей, n-токсин расщепляет нуклеиновые кислоты, тем самым нарушая реакции белкового синтеза. Фильтраты микробных культур Clostridium perfringens могут содержать также различные токсические вещества (например, фибринолизин и гиалуронидазу).

Энтеротоксин образуют Clostridium perfringens типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции, по своей природе он термолабильный протеин, продуцируемый при споруляции бактерий в толстой кишке, его практически не образуют лабораторные культуры, и он быстро разрушается при термической обработке пищевых продуктов, что значительно затрудняет его биохимическое изучение и идентификацию; вызывает рвоту и диарею, оказывает летальное действие, а также обусловливает появление эритематозной кожной сыпи у лабораторных животных. Диарея развивается вслед­ствие потери воды и электролитов за счет дилатации и повышения проницаемости капилляров.

Газовая гангрена развивается при попадании Clostridium perfringens на раневые поверхности, где бактерии активно размножаются в условиях пониженного содержания кислорода. Микроорганизмы, а чаще их споры, могут быть занесены в раны из внешней среды, а также с кожи или из ЖКТ пациента Для поражений характерны некроз тканей и образование газа с гнилостным запахом. Обильное образование газа характерно преиму­щественно для анаэробных раневых инфекций, вызванных данным микроорганизмом, из­вестным также как палочка газовой гангрены. Характерная особенность гистологи­ческих препаратов, полученных из очагов поражения — практически полное отсутствие фагоцитов в очаге некротических поражений.

Пищевые токсикоинфекции, вызванные серотипами А и С, приобретают все боль­шую значимость и представляют актуальную проблему для здравоохранения боль­шинства стран мира.

Clostridium perfringens типа А вызывает преимущественно токсикоинфекции легкой и средней тяжести, инкубационный период составляет 6-24 ч; заболевания развиваются остро, с ощущениями боли в животе, рвотой (иногда с кровью) и диареей (до 20 раз в сутки), общие нарушения проявляются слабостью, головокружениями, повышение тем­пературы наблюдают редко. Симптомы исчезают в последующие 12-24 ч. Летальные исходы наблюдают редко, обычно у ослабленных пациентов — пожилых лиц, хрони­ческих больных и детей с нарушениями питания. Следует помнить о способности микроорганизмов проникать в кровоток и вызывать тяжелый анаэробный сепсис.

Более тяжело протекает некротический энтерит, вызванный штаммами серотипа С. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента в течение 12-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серотипа А, и обусловле­ны действием b-токсина, подобные пациенты нередко попадают на операционный стол с диагнозом «кишечная непроходимость», смертность достигает 35%. Заболевание регистрируют достаточно редко; большое число случаев наблюдали в Германии после второй мировой войны (в 1945-1948 гг. — 1056 случаев), а в настоящее время пе­риодически отмечают в Новой Гвинее, что связано с особенностями национальной кухни.

Термоустойчивость спор. Даже внутри серотипа А она может меняться в зависи­мости от штамма.

При варке мяса некоторые споры погибают в течение нескольких минут, тогда как другие выдерживают кипячение в течение часа и дольше (особенности штамма). Споры, находящиеся в жировой ткани, выживают на протяжении длительного времени (до 6 часов).

Повышение температуры до 75°С стимулирует прорастание спор, температурный оптимум для роста в вареном мясе 43°С, в оптимальных условиях дочерние популя­ции образуются в течение 12-13 минут.

Лабораторная диагностика

В соответствии с методическими указаниями по лабораторной диагностике (1979) предусмотрено обнаружение и идентификация токсина в содержимом тонкого кишечника в реакции нейтрализации на белых мышах. Параллельно проводится выделение и идентификация возбудителя по тинкториальным, культуральным и токсигенным свойствам, изучение ферментативных свойств не предусмотрено. Используются лабораторные животные.

Выделение проводят по общепринятой схеме (рис. 2). При смешанных инфекциях можно прогреть исследуемый материал и выделить Clostridium perfringens из термоустойчивых спор, внесенных в питательную среду, с последующим развернутым анализом.

Идентификация микроорганизма осуществляется набором стандартных тестов — подвижность, серологические реакции и др.; Clostridium perfingens также можно идентифицировать по росту на яичном агаре: колонии С. perfringens окружены опалесцирующим белым «преципитатом», появляющимся под действием a-токсина (лецитиназы С); образо­вание зон преципитации можно ингибировать, наслоив на половину чашки специфическую антисыворотку одновременно с посевом тест-культуры.

Рисунок 2. Схема бактериологического исследования на Clostridium
perfringens

Столбнячная палочка

Clostridium tetani вызывает столбняк — тяжелое заболевание, опосредованное нейротоксическим действием бактериального экзотоксина (тетаноспазмина), ведущее проявление — судорожный синдром, включающий болезненные сокращения мышц (тетанус) и длительное напряжение мышц (мышечная ригидность). Характерными проявлениями последнего считаются опистотонус (тетанический спазм, при котором позвоночник и конечности согнуты, больной лежит на спине и опирается на затылок и пятки) и risus sardonicus (risus caninus) — подобие оскала, вызванного спазмом мышц головы. Возбудитель столбняка практически одновременно открыли Монастырский (1883) и Николайер (1884), в чистой культуре впервые выделен Китазато (1889).

Распространение

Микроорганизмы встречаются повсеместно, но точных статистических данных об их распространении нет, так как во многих странах болезнь не подлежит обязательной регистрации. Тем не менее, ежегодная смертность от столбняка превышает 100 000 человек.

Естественный резервуар и источник инфекции — почва, хотя многие исследователи бопее склонны считать резервуаром инфекции толстую кишку сельскохозяйственных и диких животных. Входные ворота инфекции — бытовые и производственные травмы, причем наибо­лее часто поверхностные, когда больной не обращается за медицинской помощью.

Повышенную заболеваемость отмечают в регионах с теплым климатом, создающим усло­вия не только для длительного сохранения спор в почве, но и для их прорастания и размножения вегетативных форм.

Заболеваемость значительно возрастает во время военных действий у раненых; основ­ная группа риска в мирное время — работники сельского хозяйства (составляют 80-86% заболевших).

Морфология возбудителя

Вегетативные клетки. Бактерии представляют собой грамположительные палоч­ки с закругленными концами длиной 4-8 мкм и толщиной 0,3-0,8 мкм (в молодых куль­турах иногда образуют нитевидные клетки), располагаются одиночно или цепочками, подвижны (содержат 20 и более жгутиков, расположенных по периферии клетки), но в старых культурах (30 сут. и более) преобладают неподвижные формы. Облигатные (строгие) анаэробы, отличаются высокой чувствительностью к О2
; у бактерий отсут­ствуют цитохромы, цитохромоксидаза, пероксидаза и каталаза.

Споры круглые, реже овальные, расположены терминально, их диаметр в 2-3 раза превышает толщину бактерий, вследствие чего спорангий имеет форму теннисной ракет­ки или барабанной палочки. Их отличает высокая устойчивость к химическим и физичес­ким воздействиям, в частности, они выживают в течение 8-10 ч в 1% растворе сулемы и 5% растворе фенола, а также выдерживают кипячение в течение 0,5-1 ч. Спорообразование начинается на 2-3 сутки; на 4-6 сутки роста на жидкой среде вегетативные клетки разру­шаются, и в среде остаются почти одни споры.

Морфология колоний. На МПА и желатине в строго анаэробных условиях возбуди­тель растет медленно и образует тонкие прозрачные колонии с ровными или шероховаты­ми краями, рост колоний характерный — сначала на поверхности среды появляется се­точка, образованная сливающимися колониями с отростками. Растет в виде прозрачных или серовато-желтых шероховатых (R) и гладких (S) колоний. При посеве стол­биком в полужидкий агар через 24-48 ч формирует колонии в виде чечевичек (R-форма) или пушинок с плотным коричневым центром (S-форма).

Антигенная структура

У Clostridium tetani выявляют О- и Н-Аг. По жгутиковым Аг выделяют 10 сероваров, все серовары продуцируют идентичные по своим антигенным свойствам тетаноспазмин и тетанолизин.

Биохимия

Основные продукты метаболизма — уксусная, масляная, пропионовая кислоты, этанол. Большинство штаммов не обладает сахаролитической активностью, но выделено несколько штаммов, ферментирующих глюкозу. Clostridium tetani проявляет слабые протеолитические свойства; медленно расщепляет белки и пептоны до аминокислот (последние разлагаются до угольной кислоты, водорода, аммиака, летучих кислот и индола); для роста необходимы аргинин, гистидин, тирозин, валин, изолейцин, лейцин и триптофан. Бактерии образуют желатиназу и рениноподобный фермент, опосредующий появление затемненных зон вокруг колоний С. tetani на молочном агаре.

Патогенность

Патогенность Clostridium tetani обусловлена способностью образовывать тетаноспазмин и тетанолизин: действие этих токсинов на организм, в особенности тетаноспазмина, вызывает столбняк у человека и животных.

Тетаноспазмин — полипептид; Mr
150 000 Д; действует дистанционно, т.к. бактерии редко покидают пределы раны. Считают антигенно однородным, хотя обнаружено 4 груп­пы детерминант, но их структура и локализация плохо изучены. Токсин фиксируется на поверхности отростков нервных клеток, проникает в них (за счет лигандопосредованного эндоцитоза) и посредством ретроградного аксонного транспорта попадает в ЦНС. Меха­низм действия связан с подавлением высвобождения тормозных нейромедиаторов (в ча­стности, глицина и g-аминомасляной кислоты) в синапсах (токсин связывается с синаптическими белками синаптобревином и целльбревином).

Первоначально токсин действует на периферические нервы, вызывая местные тетанические сокращения мышц. Токсин появляется в культурах на 2 сутки, достигая пика образования к 5-7 дню. Разрушается при длительном хранении в термостате, под действием света и кислорода.

Для получения токсина in vitro бактерии можно выращивать на мясных средах, напри­мер бульоне Мартена с пептоном, среде Мюллера с настоем бычьего сердца и пепто­ном из триптического гидролизата казеина; в отечественной практике наибольшее распространение получила среда из кислотного гидролизата казеина, экстракта пше­ничных отрубей и дрожжевого экстракта (в среду можно добавлять рыбную муку).

Тетанолизин (тетаногемолизин) Clostridium tetani обладает гемолитическим, кардиотоксическим и летальным свойствами, в патогенезе заболевания играет менее важную роль; максимальноe накопление токсина в культуре наблюдают уже через 20-30 ч, процессы его образования не связаны с синтезом тетаноспазмина.

Клинические проявления

Легкая форма (локальный столбняк) характеризуется периодическими спазмами в пораженной области.

Мозговые поражения включают поражения черепных нервов (наиболее часто — VII); характерны тонические спазмы мышц головы и глотки.

Генерализованный столбняк — наиболее часто встречаемая форма с характерными мышечными спазмами; из других проявлений можно отметить тахикардию, аритмии, менингит, гипокальциемию.

Иммунитет

Естественный иммунитет к столбняку отсутствует. В отношении постинфекционного иммунитета существуют противоречивые данные: некоторые авторы считают, что он не формируется, тогда как другие выявляли антитоксин в сыворотках переболевших лиц в концентрациях 0,001-1,5 АЕ/мл.

Иммунопрофилактика. Со времен Беринга и Китазато известно, что введение в организм обезвреженного токсина создает выраженный иммунитет к столбняку. Позднее Рамон разработал метод его получения; его высокую эффективность подтвердили единичные случаи столбняка в войсках союзников во время второй мировой войны. Иммуногенные свойства анатоксина увеличивает его сорбция на гидроокиси алюминия. В настоящее время столбнячный анатоксин применяют для активной иммунопрофилактики столбняка, первичною вакцинацию проводят детям в возрасте с 5-6 месяцев до 5 лет (курс включает 3 инъекции с интервалом 30-40 суток); при заболевании применяют столбнячный анти­токсин – гипериммунную человеческою антисыворотку (курс — 2 инъекции, в тяжелых случаях — 3 инъекции дробно).

Лабораторная диагностика

Возбудитель обычно обнаруживают в месте проникновения в организм больного. Поэтому наиболее рационально исследование различного материала, взятого в месте ранения. В тех случаях, когда входные ворота неизвестны, следует тщатель­но осмотреть больного для выявления ссадин, царапин, катаральных и воспалительных процессов, необходимо обратить внимание на старые рубцы после ранения, т.к. возбудитель может долго в них сохраняться; в некоторых случаях исследуют слизь из носа, бронхов, глотки, налет с миндалин, а также выделения из влагалища и матки (при послеродовом столбняке или аборте). При бактериологическом исследовании трупов также принимают во внимание возможность генерализации инфекции. Для анализа забирают кровь (10 мл) и кусочки печени и селезенки (20-30 г).

Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме (рис. 3) Исследованию подлежит материал от больного или трупа, перевязочный и шовный хирургический материал, а также почва, пыль и воздух.

Рисунок 3. Схема бактериологической идентификации Clostridium
tetani

Биологическая проба. При исследовании материала от больного или трупа параллельно бактериологическому анализу проводят обнаружение столбнячного анатоксина в биологической пробе на мышах. Для этого материал измельчают, добавляют двойной объем физиологического раствора, инкубируют в течение часа при комнатной температуре, фильтруют, часть фильтрата смешивают с противостолбнячной сывороткой из расчета 0,5 мл (200 АЕ/мл) сыворотки на 1 мл экстракта и инкубируют 40 минут. Затем одной группе животных вводят экстракт без предварительной инкубации с сывороткой, а дру­гой группе — проинкубированную смесь, при наличии Clostridium tetani у животных первой группы развиваются симптомы столбняка.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum — возбудитель ботулизма, тяжелой, часто фатально заканчива­ющейся пищевой токсикоинфекции. В России первое клинико-эпидемиологическое описание ботулизма привел Зенгбуш (1818); возбудитель открыл ван Эрменген (1869).

Распространение

Clostridium botulinum широко распространены в почве. Заболевание реги­стрируют повсеместно, исключая районы вечной мерзлоты. Наиболее часто заболевания вызывают типы А и В, тип G первично выявлен в Аргентине, а тип Е более распространен в регионах, включающих большие естественные водоемы, — Северной Японии, области Вели­ких озер (США, Канада), Швеции, Дании, Британской Колумбии (Канада), РФ, где бактерии настолько обильно колонизируют придонный ил, что отмечаются случаи заражения рыб. Пе­риодическое пересыхание водоемов стимулирует рост Clostridium botulinum. Для профилак­тики интоксикаций продуктами промышленного производства при консервировании мяса широко применяют нитриты; в этом плане наибольшую опасность представляют мясные, рыбные и овощные консервы домашнего приготовления.

Естественный резервуар и источник инфекции — почва и различные животные.

Морфология возбудителя

Вегетативные клетки — палочки с закругленными концами размером 4-8´0,6-0,8 мкм, подвижны (перитрихи). При неблагоприятных условиях образуют эндоспоры, расположенные терминально и субтерминально. Строгие анаэробы; молодые культуры окрашива­ются грамположительно, 4-5-суточные — грамотрицательно. Оптимум рН для роста 7,3-7,6, для прорастания спор 6,0-7,2.

Морфология колоний. На кровяном ага­ре с глюкозой образуют очень мелкие серо­ватые или мутные желтоватые колонии линзообразной формы (на различных средах у одного и того же штамма могут варьировать). Вокруг колонии образуются зоны гемолиза различной ширины. На печеночном агаре образуют полиморфные звездчатые колонии, на желатине — сероватые, окруженные зоной разжиженного желатина. На столбике агара можно обнаружить диссоциаты, R-формы име­ют форму чечевичных зерен, S-формы — пушинок. Хорошо растут на жидких средах (обычно на бульоне Тароцци, бульонах из гидролизатов казеина, мяса или рыбы) при условии предварительного удаления О2
из среды кипячением в течение 15-20 мин с быстрым охлаждением. Вызывают помутнение среды и газооб­разование, иногда имеется запах прогорк­лого масла, но этот признак непостоянен.

Антигенный состав

Серологическая иден­тификация Clostridium botulinum основана на выявлении токсинов, по их структуре бактерии разделяют на 8 сероваров — А, В С1(
a
)
, С2(
b
)
, D, Е, F и G. Антигенная структура бактерий остается малоизученной, показано наличие жгутиковых, группоспецифических (Н) и соматических, типоспецифических (О) Аг, не проявляющих токсических свойств. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна для бактерий типов А, В, С и D 35°С, для бактерий типов Е и F 28-30°С

Биохимические свойства

Все типы Clostridium botulinum образуют желатиназу, лецитиназу и Н2
S, проявляют широкий спектр сахаролитической активности (бактерии типов А, В, Е и F ферментируют глюкозу, левулезу, фруктозу, мальтозу и сахарозу типов С и D — глюкозу и мальтозу, тип G инертен к углеводам). Clostridium botulinum типов А и В облада­ют выраженными протеолитическими свойствами, разлагают свернувшийся яичный белок и гидролизуют желатин По биохимическим свойствам выделяют 4 группы.

Бактерии I группы
проявляют выраженные протеолитические свойства, гидролизуют желатин и эскулин, ферментируют глюкозу и мальтозу, проявляют липазную активность на яичном агаре.

Бактерии II группы
проявляют сахаролитическую активность, но лишены протеолитической.

Бактерии III группы
проявляют липазную активность и гидролизуют желатин.

Бактерии IV группы
гидролизуют желатин, но, в отличие от прочих возбудителей ботулизма не проявляют сахаролитических свойств и липазной активности, что послужило основанием для предложения выделить их в отдельный вид —Clostridium argentiense.

Патогенность

Патогенность Clostridium botulinum различна для различных видов млекопитающих; забо­левания человека вызывают бактерии типов А, В, Е и F; Clostridium botulinum типов С и D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана.

Клинические проявления преимущественно обусловлены действием нейротоксина (т.к. в условиях организма размножение вегетативных форм Clostridium botulinum зат­руднено) и включают:

· классическую пищевую токсикоинфекцию, более распространен­ную под названием «ботулизм»;

· раневой ботулизм (возникает при загрязнении некротизированных тканей почвой);

· ботулизм новорожденных (у детей от 3 до 20 недель), характерны генерализованная гипотония и амиотрофия, развивается при заглатывании спор с последующим развитием вегетативных форм (в США ежегодно регистрируют око­ло 70 случаев);

· неопределенно классифицируемый ботулизм (у детей старше одного года и взрослых), не связанный с указанными факторами риска (пища, рана).

Фармакокинетическая активность токсинов различных типов Clostridium botulinum практически одинакова: все они сорбируются на клетках слизистой оболочки кишечника, проникают в кровь (где их можно выявить серологически) и в периферические нервные окончания. Фармакологическое действие включает связывание Н-цепи токсина с мембраной, поглощение токсина и формирование пор в синаптических пузырьках (каждую пору фор­мируют 4 молекулы токсина), что приводит к блокированию слияния синаптических пу­зырьков с мембраной; мишень для действия — интегральные синаптические белки. В частности, токсины серотипов В, D и F расщепляют синаптобревин, А и Е — SNAP-25, С — синтаксин, D и F — целлюбревин. Избирательно поражают a-моторные нейроны пере­дних рогов спинного мозга, что обусловливает характерные параличи мышц. Токсины термолабильны, но для полной инактивации требуется кипячение в течение 20 минут.

Клинические проявления. Временной интервал между попаданием токсина в орга­низм и появлением первых признаков ботулизма обычно не превышает 24 ч, но может варьировать от 4-6 до 96 ч и более. Проявления зависят от природы продукта, ставшего причиной отравления, количества токсина, поступившего в организм, и состояния боль­ного. Первые, но непостоянные признаки — расстройства ЖКТ (тошнота, рвота, боли в животе). Часто больные жалуются на сухость во рту или гиперсаливацию. Одновремен­но развиваются головная боль и нервно-паралитические явления — нарушение гло­тания, дисфагия и офтальмоплегический синдром; часто наступают односторонний или двусторонний блефароптоз и анизокория — результат поражения сфинктера зрачка. Циркуляция токсина в кровотоке приводит к уменьшению притока крови к правому пред­сердию. Кроме поражения ЦНС, ботулотоксин вызывает периферические поражения не­рвно-мышечной передачи, проявляющиеся сначала вялостью движений или полной ади­намией с последующим развитием парезов и/или параличей глазных, глоточных и гортанных мышц, а также мышц шеи и конечностей.

Довольно часто случаи детского ботулизма связаны с кормлением детей медом. Первый такой случай зарегистрирован в 1943г.; симптоматика раневого ботулизма аналогична таковой при пищевом отравлении и обусловлена действием токсина, выде­ляемого бактериями в ране.

Токсин Clostridium botulinum — белок, оказывающий нейротоксическое действие. В зависимости от типа возбудителя, идентифицируемого по антигенной структуре токсина, Mr
может варьировать от 60 до 150 кД. Представлен Zn2+
-зависимыми эндопептидазами, при протеолизе разлагается на 2 связанных дисульфидной связью фрагмента (L- и Н-цепи). Механизм биологической активности реализуется через связывание Н-цепи с мембраной, проникновение токсина в клетку, формирование пор в пузырьках (каждую пору формиру­ют 4 молекулы токсина), что приводит к блокированию слияния синаптических пузырь­ков с мембраной. Токсин разрушается при кипячении, легко кристаллизуется в белый хлопьевидный порошок. Токсины всех типов также оказывают гемолизирующее действие.

Иммунитет

Чувствительность к ботулиническому токсину у различных животных (в том числе одного вида) подвержена резким колебаниям. Абсолютно резистентные виды неизве­стны, но всеядные животные обладают меньшей чувствительностью. Динамика заболевания не сопровождается выработкой значимых титров AT, что связано с незначительной (с точки зрения иммуногенных свойств) дозой токсина, вызвавшей поражение. Перенесенное заболевание не оставляет антитоксического иммунитета. У выздоровевших пациентов в сыворотке определяют AT к токсинам и микробным клеткам, что свидетельствует о комплексном харак­тере иммунного ответа, направленного как на связывание токсина, так и на элиминацию возбудителя. Следовательно, ботулизм можно рассматривать не только как интоксикацию, но и как токсикоинфекцию (конечно, не отрицая ведущей роли токсина в патогенезе заболевания).

Лабораторная диагностика

Выделение возбудителя проводят по общепринятой схеме (рис. 4). Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал, полученный от больного, секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл и разводят 3-4% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1, промывные воды из желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал — 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде.

Кровь исследуют только на наличие токсина с помощью биологической пробы на мышах (вводят 2 мл) или морских свинках (вводят 5-8 мл). Испражнения исследуют только на наличие возбудителя посевом на питательные среды, весь остальной материал — на наличие токсина и возбудителя. Банки с консервами выдерживают в термостате 10-12 суток, стерильно отбирают 50-100 г, растирают и центрифугируют, в надосадочной жидкости определяют токсин, в осадке — возбудитель. Мясо и рыбу обрабатывают спиртом и забирают пробы из внутренних частей (пробы рыбы рекомендуют брать от хребта и внут­ренних органов). Пробы изучают аналогично исследованиям консервированных продуктов.

Рисунок 4. Принципиальная схема бактериологического выделения Clostridium
botulinum

Clostridium novyi

Clostridium novyi (Clstridium oedematiens типа А) — как и Clostridium perfringes – основной возбудитель анаэробной раневой инфекции, также известной как газовая гангре­на, газовый или злокачественный отек, инфекционного некротического гепатита овец. Впервые раневая госпитальная гангрена была описа­на Паре в 1562 г, через 3 столетия Вельпо (1839) опубликовал свои наблюдения над подобным заболеванием, названным им «травматическая эмфизема». Полное описание клинической карти­ны и течения разлитых форм газовой инфекции, наблюдаемых им во время Севастопольской и Кавказской кампаний, дал Н.И. Пирогов. Позднее Веинберг и Сэган (1891) установи­ли, что открытая ими бацилла злокачественного отека (Clostridium oedematiens типа А) способна вызывать инфекции у человека; возбудитель позднее (1894) был охарактеризован Нови и получил его имя. В годы второй мировой войны инфекции, вызванные Clostridium novyi, составляли 42% случаев гангрены. Микроорганизм широко распространен в природе, может быть выделен из почвы, осадочных отложений, а также из органов ЖКТ здоровых животных.

Морфология и культуральные свойства

Вегетативные клетки. Крупные или слегка изогнутые подвижные грамположительные палочки размером 4-10´1-2мкм; перитрихи (20-25 жгутиков). Обладают выраженным полиморфизмом (некоторые штаммы образуют короткие цепочки или нити); при старении теряют способность окрашиваться по Грaму, но хорошо красятся анилиновыми красителями. В молодых культурах похожи на Clostridium perfringens, но отличаются подвижностью. Облигатный анаэроб (при пересевах колонии, выросшие на поверхности питательных сред, следует как можно меньше держать на воздухе). Молодые клетки хорошо окраши­ваются основными анилиновыми красителями, бактерии из старых культур могут изменять отношение к окраске по Граму.

Споры овальные, расположены центрально или субтерминально. На мясных и казеиновых средах спорообразование наблюдают на 2-6 сутки. Лучше всего споры образуются на средах, бедных утилизируемыми углеводами и другими питательными веществами. На обогащенных средах спорообразование менее обильное и более медленное. Устойчивы к нагреванию (выживают при кипячении в тече­ние 1-2 ч), в костях животных сохраняются до 10 лет.

Морфология колоний. На плотных средах в анаэростате уже через 48 ч образуют круглые сочные сероватые полупрозрачные колонии, иногда с зернистой поверхностью и неровными краями. Различают несколько типов бактерий. Бактерии типов А, В и С имеют тенденцию к образованию дочерних и подвижных колоний. На кровяном агаре возбудитель склонен образовывать шероховатые колонии, у бактерий типов А, В и С они окружены зоной гемолиза. Бактерии типа D эритроциты не разрушают. Колонии типов А и В, выросшие на кровяном агаре с бензидином, быстро чернеют на воздухе (за счет образования Н2
О2
). В глубине агара образуются колонии, напоминающие линзы, комочки ваты, снежные хлопья и т. д., часто окрашены в желтоватый или коричневатый цвет. На жидких средах колонии растут сравнительно медленно и вызывают сдвиг рН в кислую сторону (за счет образования органических кислот и Н2
S). На мясо-пептонных бульонах с 0,5% глюкозы или 3% декстрина при 37°С происходит равномерное помутнение среды, затем образуется рыхлый осадок.

Антигенная структура

Серологическая идентификация основана на выявлении соматических Аг; у штаммов типов А, В и D антигенная структура представлена 2 одинаковыми соматическими Аг, находящимися в различных соотношениях, антисыворотки к штаммам типа В могут иногда перекрестно реагировать с Аг других типов.

Биохимические свойства

Бактерии типов А, В и С ферментируют глюкозу, фруктозу и мальтозу, а тип D — только глюкозу, глицерин разлагают все микроорганизмы (кроме не­скольких штаммов типа В). Показано наличие у бактерий типа А глицерокиназы, α-амилазы и α-глюкозидазы, что указывает на способность разлагать полисахариды путем гидролиза и фосфорилирования. Протеолитические свойства у Clostridium novyi выражены сравнительно слабо, все штаммы разлагают желатин, свертывают молоко (медленно), но не разлагают свернувшийся яичный белок (исключая несколько штаммов), бактерии типа D образуют индол и H2
S.

Патогенность

Clostridium novyi типов А и В вызывают газовую гангрену у человека и животных (наиболее частый возбудитель — тип А). Бактерии вырабатывают 8 токсинов, определяющих их патогенность (табл. 6). g-токсин (фосфолипаза) и b-токсин (некротическая, гемолитическая лецитиназа С) не тождественны одноименным токсинам Clostridium perfringens. a-токсин – термолабильный, некротизирующий токсин (его продуцируют культуры типа А и В), кроме того, Clostridium novyi образует гиалуронидазу, идентичную m-токсину С. perfringens. Культуры патогенны для многих лабораторных животных (мыши, морские свинки, кролики, крысы). У морских свинок на месте инъекции образуется желатинозный, студенистый отек. У 50% штаммов культуральная жидкость токсична для мышей.

Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика включает серологическую идентификацию Аг возбудителя и AT к ним в различных биологических жидкостях организма и выделение культуры возбудителя (аналогично бактериологическому исследованию на наличие Clostridium perfringens), что в случае Clostridium novyi представляет определенные трудности. Дифференциальную диагностику от прочих клостридий, вызывающих анаэробные инфекции, проводят оценкой сахаролитических, протеолитических и некоторых других биохимических свойств (табл. 7).

Таблица 6. Токсины, вырабатываемые различными типами Clostridium novyi

Токсин	Биологическая активность	Тип А	Тип В	Тип С	Тип D
a	Термолабильный, летальный, некротический	+	+	–	–
b	Лецитиназа С, летальный, некротический, гемолитический	–	+	–	+
g	Лецитиназа, некротический, гемолитический	+	–	+(?)	–
d	О2 -лабильный, гемолизин	+	–	–	–
e	Липаза	+	–	–	–
x	Гемолизин, О2 -стабильный	?	+	–	–
h	Тропомиозиназа	–	+	–	+
q	Активность неизвестна, вызывает помутнение лецитовителлина	–	+	–	+
	Вызываемые заболевания	Анаэробная инфекция	Анаэробная инфекция, «черная болезнь» травоядных	Хронический остеомиелит буйволов	Бациллярная гемоглобинурия телят

Таблица 7. Признаки некоторых патогенных клостридий

Признак	С . perfringens	С . novyi	С . septicum	С . hislolyticum	С . sporogenes	С . bifermentans	С . sordellii	C.fallax
Подвижность	–	+	+	+	+	+	+	+
Сахаролитические свойства:
глюкоза	+	+	+	±	+	+	+	+
левулеза	+	±	+	±	–	–	+	+
лактоза	+	±	+	±	–	–	–	±
сахароза	+	±	±	±	–	–	+	+
галактоза	+	±	+	±	+	–	–	±
мальтоза	+	±	+	±	+	–	+	+
инулин	–	–	–	±	–	–	–	±
маннит	±	±	±	±	–	–	±	–
дульцит	–	–	–	–	–	–	–	–
салицин	–	±	+	±	–	+	–	±
глицерин	±	+	±	±	–	–	+	–
крахмал	+	–	–	–	–	–	–	–
Свернувшаяся сыворотка	±	–	–	+	+	+	+	–
Гемолитическая активность	±	+	+	+	+	+	+	±
Лакмусовое молоко	КГ, сгусток через 3-16 ч	Свертывание за несколько сут	То же	Пептонизация	То же	То же	То же	Медленная пептонизация
Агар с бензидином	–	Почернение	–	–	–	–	–

КГ — ферментация с образованием кислоты и газа.

Прочие возбудители анаэробной раневой инфекции

Помимо Clostridium perfrigens и Clostridium novyi, патологические процессы у человека и животных могут вызывать и другие клостридии. Исторически многообразие форм анаэробных поражений привело к тому, что к началу первой мировой войны имелось 71 наименование, обозначающее анаэробную инфекцию, за время вой­ны их дополнили 20 названиями, а к концу войны — еще 16. В 1861 г. Пастер описал «септичес­кий вибрион», а со времени выделения культуры совместно с Жубером (1977) Vibrion septique длительное время оставался единственным идентифицированным патогенным микробом, с дей­ствием которого связывали многие заболевания. Дальнейшая история открытия возбудителей анаэробных инфекций включает выделение сапрофитов С.pulrificus (Биншток, 1883) и Clostridium sporogenes (И. И. Мечников, 1908), а в 1915 г. Вейнберг и Сэгэн выделяют C.fallax, «бациллу злокачественного отека» Clostridium oedematiens (1915) и «тканерасплавляющую» бацил­лу Clostridium histolyticum (1917). Характерная особенность микроорганизмов — способность проявлять патогенное свойство в условиях смешанных раневых инфекций. Все они грамположительные анаэробы (но некоторые относительно толерантны к O2
), образуют споры, форма которых варьирует от круглой до цилиндрической. Принцип выделения возбудителей напомина­ет таковой при выделении культуры С. perfringens.

Clostridium histolyticum

Подвижная палочка (также встречаются неподвижные изоляты) раз­мером 3-5´0,5-0,8 мкм; грамположительна, но в старых культурах может быть грамотрицательной. В мазках часто образует пары или короткие цепочки, иногода единичные бактерии. Очень подвижна в молодых культурах, клетки из старых культур неподвижны (также известны изначально неподвижные штаммы). Почти на всех средах быстро образует субтерминальные споры («игольное ушко») с трехслойной оболоч­кой, не деформирующие клетку. Строгий анаэроб, растет при давлении 3-15 мм рт.ст. (оптимум 8 мм рт.ст.), но обладает аэротолерантностью, оставаясь жизнеспособной в аэроб­ных условиях в течение 10 ч. В аэробных условиях растет плохо и не образует спор и образует колонии меньшего размера. В анаэробных условиях на кровяном агаре образует прозрачные выпуклые колонии диаметром 0,5-1 мм, окруженные тонкой зоной гемолиза. При продолжительном отборе можно полу­чить штаммы, формирующие колонии в виде головы Медузы. В толще агара неподвижные штаммы образуют «пушинки» с уплотненным центром, подвижные — чечевицеобразные колонии или колонии с протуберанцем. Вызывают сплошное помутнение жидких сред с протеолизом кусочков мяса и печени на дне. Через 2 сут среда становится прозрачной, а на дне образуется осадок. рН почти не меняется; запах отсутствует. Инертны к углеводам (к ферментации без образования кислоты способны лишь некоторые штаммы); не образуют индол, но вырабатывают в больших количествах сероводород. Проявляют выраженные протеолитические свойства — разлагают желатин, свернувшуюся сыворотку, яичный белок и коллаген (табл. 7). Продуцируют 5 серологически идентифицируемых токсинов: a-токсин (основной токсин), оказывающий летальное и некротическое действие; b-токсин (коллагеназа), расщепляющий азоколл и желатин; g-токсин (протеиназа), активируемый восстановителями и не разрушающий нативный коллаген, но расщепляющий азоколл, желатин и казеин; d-токсин (эластаза), проявляющий аналогичную активность; e-токсин, проявляющий О2
-зависимую гемолитическую активность (лабилен к кислороду, в антигенном отношении близок к стрептолизину О). У животных Clostridium histolyticum – один из возбудителей злокачественного отека (газовой гангрены), обычно в ассоциации с прочими анаэробами. Clostridium histolyticum патогенны для лабораторных животных. Морские свинки при внутримышечной иньекции свежей вирулентной культуры, выращеной на мясной среде, погибают в период от нескольких часов до нескольких дней. В зоне инъекции наблюдается расплавление мышц, газа не образуется, гнилостного распада нет.

В соответствии с действующей инструкцией при лабораторной диагностике злокачественного отека проводится микрокопическое исследование, подкожное заражение морских свинок изучаемым материалом в область брюшных мышц, изучение тинкториальных и культуральных свойств выделенной культуры.

Clostridium septicum (палочка Гона-Сакса)

Возбудитель злокачественного отека, брадзота овец. Обнаруживается в почве, кишечном тракте домашних животных, при соответствующей патологии животных и человека. Полиморфные подвижные палочки размером 4-5´0,8 мкм; в тканях способны образовывать нити длиной до 500 мкм. В культурах клетки могут быть яйцевидные, веретеновидные, образуют цепочки. При контакте с О2
теряют подвижность, но не так быстро, как С. oedematiens. Через 24 ч культивирования образуют субтерминальные споры. Строгие анаэробы; растут при давлении 8-15 мм рт.ст. (выдержи­вают до 25 мм рт.ст.). Остаются жизнеспособными при доступе О2
в течение 10 ч. На поверхности твердых сред образуют блестящие полупрозрачные колонии (диаметром до 4 мм) с неровными краями (имеют тенденцию к ползучему росту). На агаре Цейсслера через 48 ч палочки образуют сплошной нежный налет, окруженный зоной гемолиза. В столбике 1% агара формируют колонии с отходящими переплетающимися нитями, на 2% агаре колонии имеют вид дисков, иногда с протуберанцем. Ферментируют некоторые углеводы и не раз­лагают (практически все штаммы) сахарозу (что используют для дифференциальной ди­агностики с С.chavoei); протеолитическая активность выражена умеренно (см. табл. 7). На среде Китта-Тароцци дает обильный рост; газообразование вариабельное; через 2 суток образует осадок. Продуцируется 4 экзотоксина: a-токсин, основной фактор патогенности, проявляющий летальную, некротизирующую и гемолитическую активность; b-токсин, обладающий свойствами ДНКазы; g-токсин (гиалуронидаза); d-токсин, проявляющий свойства О2
-лабильного гемолизина. При дифференциации от Clostridium chavoei используют следующие тесты: гемагглютинация эритроцитов барана, гемолиз эритроцитов курицы (Матвеев, Быченко 1973).

Clostridium chavoei

Возбудитель эмфизиматозного карбункула крупного рогатого скота и овец. Бактериальные клетки отличаются полиморфизмом, особенно в живой ткани, могут иметь форму лимона, груши, в мазках чистой культуры - прямые или слегка изогнутые палочки, одиночные, пары, реже короткие цепочки. По своим биологическим и антигенным свойствам мало отличается от Clostridium septicum, некоторые авторы рассматривают его как подвид С.septicum: С.septicum тип А и С. chavoei тип В. Однако каждый из этих микроорганизмов полностью нейтрализует только гомологичная сыворотка, а при дифференциальной диагностике этих микроорганизмов необходимо учитывать отсутствие полной перекрестной нейтрализации токсинов, слабую терморезистентность у С. septicum и высокую у С. chavoei, длительный инкубационный период при инфекции, вызванной первым микроорганизмом, и практически полное его отсутствие при заболеваниях, вызванных С. chavoei, способность С. septicum агглютинировать эритроциты барана и лизировать эритроциты кур. Молоко створаживает за 3-6 суток; казеин и свернув­шуюся сыворотку не разжижает; желатин не гидролизует. На кровяном агаре, среде Цейсслера образует характерные слабо выпуклые колонии в виде перламутровой пуговицы или с изрезанными краями – напоминающие виноградные листья, нежного фиолетового цвета; на средах с кровью дает a-гемолиз. На среде Китта-Тароцци характерен обильный рост, споры образует через 24 ч, колонии не имеют неприятного запаха, но старые культуры могут иметь запах прогорклого масла. Строгий анаэроб. Температурный оптимум 36-37°С. Слабо растет при 25°С и не растет при 45°С. В соответствии с методическими указаниями по диагностике эмкара, исследования включают изучение тинкториальных и культуральных свойств выделенного микроорганизма (без изучения биохимических свойств) и определение ее патогенности для морской свинки. Характерным изменением у морских свинок, зараженных подкожно в области брюшных мышц является наличие гемморагического выпота или точечных кровоизлияний на месте инъекции. Кожа от пораженных мышц отделяется с трудом, мышцы темно–красного цвета. В подкожной клетчатке обнаруживают небольшое количество пузырьков газа.

Clostridium sporogenes

Ассоциируется с возбудителем злокачественного отека. Выделяется из почвы, фекалий овец, собак и при патологических состояниях человека и животных. Подвижные палочки размером 3-6´0,5 мкм; проявляют выраженныные протеолитические свойства и биохимически инертны в отношении большинства углеводов (табл. 7). Температурный оптимум 30 – 40°С. Анаэроб. На кровяном агаре формирует колонии неправельной формы с ризоидными краями, серого цвета, выпуклые, обычно с зоной гемолиза. В агаре столбиком рост напоминает комочки ваты с плотным центром. При смешанных анаэробных инфекциях увеличивают вирулентность Clostridium perfringens и Clostridium septicum; при попадании жизнеспособных спор в мышцы способны вызывать гнойные процессы. Палочка не образует токсинов, участвующих в патогенезе анаэробной раневой инфекции.

Clostridium sordellii

Выделена Сорделли от больного газовой гангреной в Буэнос-Айресе; (1922). Один из возбудителей злокачественного отека. Обнаруживают в почве и при патологических состояниях человека и животных. Подвижная палочка размером 2-4´0,6-1 мкм; факультативный анаэроб; на плотных питательных средах уже через 24-48 ч образует выпуклые сероватые колонии с неровными краями. На агаре с эритроцитами лошади дает узкую зону гемолиза, а на шоколадном агаре образует узкую зону просветления (за счет протеолиза). На агаре с куриным желтком, молоком и лактозой формирует зону опалесценции вокруг колоний. На жидких мясных средах дает интенсивный рост, часто с образованием слизи. Ферментирует многие углеводы, но не лактозу и сахарозу, проявляет выраженные протеолитические свойства (табл. 7). Виру­лентные штаммы продуцируют высоколетальный некротизирующий токсин, напоминающий a-токсин Clostridium novyi; также образует лецитиназу С, серологически сходную с лецитиназой С. perfringens типа А, но проявляющую меньшую активность; продуцирует гемолизин типа q-токсина С. perfringens типа А и d-токсина Clostridium novyi и Clostridium septicum.

Clostridium fallax

Впервые выделена Прево из почвы тропических районов Африки. Один из возбудителей газовой гангрены. Под­вижная прямая палочка (в молодых культурах) с закругленными концами, 2-5´0,5 мкм; строгий анаэроб, температурный оптимум 37°С; на повер­хности агара через 24-48 ч образует мелкие плоские прозрачные колонии с неровными краями, по мере старения колонии становятся матовыми; в агаре с высоким столбиком образует чечевицеобразные колонии, на кровяном агаре дает узкую полоску гемолиза. Ферментирует углеводы; проявля­ет умеренную протеолитическую активность (табл. 7), свертывает молоко с образовани­ем кислоты. Не образует индола и не восстанавливает нитраты. По мнению ряда авто­ров, способна вырабатывать летальный токсин, серологически не идентифицированный до настоящего времени. Свежевыделенные штаммы вирулентны для морских свинок и мышей, вызывают серозно- фибринозный отек и некроз мышц. При пассаже вирулентность штаммов быстро теряется.

Clostridium bifermentans

По морфологии и биохимическим свойствам похожа на Clostridium sordellii, дифференциальная диагностика основана на серологической идентификации агглю­тининов спор; образует лецитиназу С. Иногда вызывает газовую гангрену у человека; вмес­те с Clostridium novyi, С.septicum, С.histolyticum и С.perfringens типа А (продуцирующими a-токсин) относится к так называемым гистотоксическим клостридиям. Неподвижная палочка размером 4-8´1-1,5 мкм, в молодом возрасте грамположительная; в мазках располагается цепочками. Быстро образует центральные или субтерминальные споры, не деформирующие клетку. На агаре Цейсслера обусловливает нежный рост, напоминающий рост С. oedematiens. На средах с кровью дает a-гемолиз; проявляет лецитиназную активность (лецитиназа С). Разжижает свернувшуюся сыворотку, гидролизует желатин, ферментирует глюкозу, левуле­зу и мальтозу. На среде Китта-Тароцци газ не образуется, через 24 ч культивирования появляется осадок. Рост сопровождается гнилостным запахом.

Clostridium difficile

Среди прочих патогенных клостридий следует упомянуть открытую Холлом и О'Тулом (1935) Clostridium difficile. Возбудитель вызывает псевдомембранозный энтероколит на фоне нерациональной терапии антибиотиками (клиндамицином, ампициллином и цефалоспоринами) и цитостатиками, вызывающими глубокий дисбаланс микрофлоры и колонизацию ки­шечника С.difficile. Бактерии продуцируют 2 вида экзотоксина — токсин А (энтеротоксин) с Mr
44 000-50 000 Д (оказывает диареегенное и летальное действие, стимулирует гуанилатциклазу) и токсин В (цитотоксин) с Mr
47 000 Д (оказывает летальное действие, значи­тельно превосходящее действие токсина А, нарушает функции мембран с потерей К+
и фибронектина, ингибирует синтез белка). Проявляет высокую резистентность к антибиотикам широкого спектра действия, что создает предпосылки для обширной колонизации кишечни­ка и секреции больших доз токсинов, вызывающих изменения кишечной стенки; чувстви­тельна к действию ванкомицина. Носительство С. difficile особенно распространено у ново­рожденных (до 50%), но именно у них наблюдают самый низкий уровень поражений. По мере развития нормальной микрофлоры (6-12 месяцев) число носителей уменьшается и среди взрослых лиц не превышает 3%. Следует помнить, что псевдомембранозный колит — сугу­бо госпитальная инфекция, доминирующая среди прочих госпитальных кишечных пораже­ний, превышая в 2-3 раза число инфекций, вызванных сальмонеллами. Среди новорожден­ных возможна контактная передача от ребенка ребенку или с руками персонала (при пеленании, кормлении и купании одними и теми же руками); среди взрослых доминируют контактно-бытовые пути госпитального распространения.

Антибиотиковый энтероколит характеризуется профузными водянистыми диареями; у 50% пациентов выявляют лейкоциты в кале и лейкоцитоз. Больные жалуются на коликообразные боли в животе, температура тела может достигать 39°С и выше.

Псевдомембранозный энтероколит характеризуется образованием и выделением с калом пленчатого материала — структур, представленных фибрином и слизью.

Питательные среды для культивирования клостридий

Среда Китта-Тароцци. Мясо или печень крупного рогатого ско­та нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным объемом МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4—7,6) и 30 минут кипятят. Затем среду фильтруют, печень (мясо) промывают водопроводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой. По 3—4 кусочка мяса (пече­ни) помещают в пробирку, наливают 7—8 мл бульона, покрывают сло­ем вазелинового масла и стерилизуют при 120°С 20 минут. Перед ис­пользованием среду регенерируют (кипятят с последующим охлажде­нием).

Кровяной агар с глюкозой. К 3%-ному МПА (рН 7,2—7,4), расп­лавленному и охлажденному до 50°С, добавляют до 1—2% стериль­ного раствора глюкозы, 15—20% свежей дефибринированной крови ба­рана или лошади. Разливают по чашкам Петри, подсушивают 20—30 минут в термостате. Культивирование проводят в анаэростате.

Полужидкий агар для строгих анаэробов (Тароцци). В бульон Мартена (рН 7,2-7,4) с 0,3-0,5% глюкозы добавляют 0,1% агара. Среду разливают по 9 мл в стерильные пробирки с кусочками варе­ного мяса, печени или фарша, стерилизуют при 120°С 30 минут. Сре­ду можно использовать, не заливая поверхность вазелиновым маслом.

Агар для трубок Виньял-Вейона. В бульоне Мартена (рН 7,4) раст­воряют 2% агара, 0,1% глюкозы. Среду разливают в узкие тонкостен­ные пробирки и стерилизуют дробно, текучим паром в течение 3 дней.

Бульон Вейнберга для анаэробов. 1 кг бычьего сердца пропуска­ют через мясорубку, добавляют к фаршу 1 л воды, нагревают до ки­пения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г печени, 400 г сви­ных желудков, 40 г соляной кислоты, 4 л воды, подогретой до 50°С, и выдерживают при этой температуре 18-24 ч. Затем подогревают до 100°С, жидкость сливают, фильтруют, добавляют 0,2% двуоснов­ного фосфорнокислого натрия и устанавливают рН 7,4. Смешивают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л полученного пептона, устанав­ливают рН 7,8—8,2 и стерилизуют при 120°С 30 минут. Бульон разли­вают по пробиркам с кусочками вареной печени, наливают стериль­ное вазелиновое масло слоем 0,5 см и вновь стерилизуют при 120° С 30 минут. Перед посевом к бульону добавляют стерильный раствор глю­козы до 0,5%.

Среда Виллиса и Хоббе. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы, 1,3 мл 1%-ного раствора нейтрального крас­ного. Стерилизуют при 115°С 15 минут, охлаждают до 50°С и добавля­ют 15 мл стерильной желточной суспензии (смешивают поровну ку­риный желток и физиологический раствор) и 60 мл стерильного обез­жиренного молока.

Железо-сульфитный агар (Вильсон, Блер, 1924). К 100 мл 3%-ного МПА (рН 7,4) с 1% глюкозы при температуре 60°С добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернокислого натрия (Na2
SO3
) и 1 мл 8%-ного раствора хлористого железа (FeCl3
), приготовленного на сте­рильной дистиллированной воде. Раствор Na2
SO3
предварительно сте­рилизуют 1 ч текучим паром. Затем среду, не стерилизуя, разливают по чашкам Петри. Сернистокислый натрий можно заменить серноватистокислым натрием (Na2
S2
O3
), а хлористое железо—сернокислым (FeSO4
). При восстановлении Na2
SO3
сульфат натрия соединяется с хлорным железом и образуется черный осадок сернистого железа (FeS). Этой способностью обладают анаэробы и некоторые аэробные бактерии, вследствие чего колонии таких микроорганизмов окраши­ваются в черный цвет. С. perfringens, обладающий большой скоростью роста, изменяет цвет среды через 1-2 ч культивирования. Другие анаэ­робы формируют зеленовато-черные колонии через 6-7 ч.

Железо-сульфитное молоко (Робинзон, Стоваль, 1937). К 100 мл обезжиренного молока добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернистокислого натрия и 1 мл 8%-ного хлористого железа. Среду готовят непосредственно перед использованием и разливают по пробиркам. На данной среде С. perfringens можно обнаружить в смеси со стрепто­кокками, которые на других средах способны заметно тормозить его рост.

Бензидино-кровяной агар (Гордон, Мак Леод, 1940). К 3%-ному МПА (рН 6,4) с 1% глюкозы, подогретому до температуры 50°С, добавляют бензидин до концентрации 9% и 10% стерильной дефиб­ринированной крови барана. Компоненты перемешивают до приобре­тения средой шоколадного оттенка, разливают по чашкам Петри и подсушивают 4-5 ч в термостате. Засеянные чашки выдерживают в анаэробных условиях в термостате 12-24 ч, а затем переносят в аэроб­ные условия. Колонии С. novyi окрашиваются в черный цвет за 15-30 минут. Раствор бензидина готовят следующим образом: к 50 мл дистил­лированной воды добавляют 0,25 г основного бензидина, 0,3 мл 1% HCl и нагревают до растворения. Раствор пригоден для употребления в течение 2 недель.

Желточно-кровяной агар (Шапина-Вегина, 1962). К 2,5%-ному МПА добавляют 10% дефибринированной крови барана, 10% желточ­ной взвеси. Среда предназначена для выявления С. novyi. Через 16 ч выращивания колонии окружены непрозрачной зоной гемолиза с на­личием на поверхности среды вокруг колоний непрозрачной пленки с жемчужным блеском. Другие бактерии (аэробы, анаэробы), как правило, не дают одновременно перламутрового слоя и зоны редукции.

Полусинтетическая среда (Bonnel, Burgian, Raby, 1959). Исполь­зуют для культивирования и быстрой селекции анаэробных бактерий. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г пептона, 5 г дрож­жевого экстракта, 2,5 г натрия хлорида, 1,3 г агар-агара и подщелачи­вают Na2
CO3
. Смесь автоклавируют при 120° С в течение 15 минут, фильт­руют и добавляют 5,5 г глюкозы, 0,5 г гидросульфита натрия (пред­варительно растворенные в небольшом количестве воды), устанавли­вают рН 7,1. Добавляют 0,001 г резазурина и встряхивают смесь в те­чение нескольких минут. Среду разливают в пробирки по 15 мл, сте­рилизуют при 110°С 30 минут, охлаждают под холодной водой. При росте анаэробов среда окрашивается в нижней части пробирки, факуль­тативных анаэробов — весь столбик среды. Среду используют 3 недели при хранении в условиях комнатной тем­пературы.

Перфрингенс-агар (O.P.S.P.-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г триптона, 5 г дрож­жевого экстракта, 5 г соевого пептона, 7 г печеночного экстракта, 1 г железа аммонийно-цитратного, 1 г натрия метабисульфита, 1,5 г трис-буфера, 10 г агара, устанавливают рН 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121 С 15 минут, затем охлаждают до 50°С, вносят до­бавки (стерильно), обеспечивающие среде селективные свойства, и разливают по чашкам Петри. Добавка «А» содержит 100 мл натрия судьфадиазина, добавка «В» — 0,5 г олеандомицина фосфата и 10000 ЕД полимиксина В сульфата. Среда состоит из 100 мкг/мл натрия сульфадиазина, 0,5 мкг/мл олеандомицина фосфата и 10 ЕД полимиксина В сульфата. Данный состав обеспечивает селективные свойства, опти­мальные для изоляции С. perfringens.

Натрия метабисульфат и железо аммонийно-цитратное являются индикаторами редукции сульфита, что влияет на формирование ко­лоний возбудителя черного цвета диаметром 2-4 мм. Рост других сульфатредуцирующих бактерий (сальмонеллы, протей, цитробактер, ста­филококки, бациллы) ингибируется. На среде могут расти энтерокок­ки, но их колонии по внешнему виду отличаются от колоний С. perfringens.

Анаэробный агар Шадпера (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптического соевого бульона, 5 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г декст­розы, 0,4 г цистеина гидрохлорида, 0,01 г гемина, 0,75 г трис-буфера, 13,5 г агара. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут.

С селективными добавками среду используют для выделения клостридий, бактероидов, флавобактерий, лактобацилл, стрептококков (ана­эробных) из проб фекалий и кишечного тракта.

Для изоляции клостридий и бактероидов к 1000 мл основного анаэробного агара добавляют 10 г порошка плаценты и 0,002 г неомицина. С целью выделения флавобактерий в 1000 м3
вносят 7 мл 0,5%-ного тиротрицина в этаноле. Для анаэробных лактобацилл и стрепто­кокков в 1000 мл вносят 10 г натрия хлорида и 0,002 г неомицина. Посевы инкубируют при 37°С в анаэробных условиях.

Основной перфрингенс-агар (пропись фирмы «Дифко», 1982). Среда используется для изготовления TSC- или SFP-агара при предва­рительной идентификации и подсчете С. perfringens.

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют триптозы—15 г, соевого пептона — 5 г, мясного экстракта (сухого) — 5 г, дрожжево­го экстракта — 5 г, натрия метабисульфита — 1 г, железа аммонийно-цитратного — 1 г, агара — 14 г. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют при 121°С 10 минут. Затем среду охлаждают до 50°С и вносят соот­ветствующие селективные добавки.

Триптозо-сульфитный циклосериновый агар (TSC-агар). В основ­ной перфрингенс-агар вносят D-циклосерин из расчета 400 мг/л и 50 мл/л желточной эмульсии. Компоненты перемешивают и готовую среду разливают в чашки Петри.

Перфрингенс-агар Шахиди—Фергусона (SFP-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В основной перфрингенс-агар вносят следующие анти­биотики: 12 мг/л канамицин-сульфат, 30000 ЕД/л полимиксин В сульфа­та и 50 мл/л желточной эмульсии. Готовую среду разливают в чашки Пет­ри. На обеих указанных средах вокруг черных колоний С. perfringens образуется опалесцирующая зона, указывающая на лецитиназную ак­тивность микроорганизма.

Анаэробный бульон Шадлера (пропись фирмы «Дифко», 1982). По составу среда аналогична анаэробному агару Шадлера, но из нее исключен агар. Используют для выращивания патогенных анаэробов, для определения антибиотикоустойчивости анаэробов методом разве­дений с выражением результата в виде МИК.

Тиогликолевый бульон (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г L-цистина, 2,5 г натрия хлорида, 5,5 г декстрозы, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г пан­креатического перевара казеина, 0,5 г натрия тиогликолята. Устанав­ливают рН 7,1, разливают по емкостям и стерилизуют при 121°С 15 минут. Перед использованием среду кипятят и охлаждают.

Рекомендуется для контроля на контаминацию различных мате­риалов анаэробными бактериями.

Анаэробный агар Уилкинс-Чангрена (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г трипто­на, 10 г желатинового пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г декст­розы, 5 г натрия хлорида, 1 г L-аргинина, 1 г натрия пирувата, 0,0005 г менадиона, 0,005 г гемина, 10 г агара. Устанавливают рН 7,1, стерили­зуют при 121°С 15 минут.

Среда рекомендуется для изоляции анаэробных микроорганиз­мов из клинических материалов, является стандартной для опреде­ления анткбиотикочувствительности анаэробных бактерий. При иск­лючении агара среда может быть использована как питательный бульон.

Обогащенный клостридиальный агар (RCM-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 3 г дрожжевого экстракта, 10 г мясного экстракта, 10 г пептона, 5 г декст­розы, 1 г растворимого крахмала, 5 г натрия хлорида, 3 г натрия аце­тата, 0,5 г цистеина гидрохлорида, 15 г агара. Устанавливают рН 6,8, стерилизуют при 121°С 15 минут.

Среда рекомендуется для исследования кишечной микрофлоры. Perry et al. (1955) использовали ее для изучения рубцовых стрепто­кокков, Bornes, Goldberg (1962), внеся в состав хлортетрациклина гидрохлорид или натрия азид, применяли среду для исследования фецес кур. С добавками крови она пригодна для обнаружения в фецес животных и людей лактобацилл, с добавками крови и неомицина — бактероидов.

Грамположительные, аэробные и факультативные кокки.

К данной группе отнесены достаточно различающиеся роды микроорганизмов, собранные для удобства в одну группу на основании двух общих признаков — сферическая форма тела и положительная окраска по Граму. Эти микроорганизмы не образуют спор, подавляющее большинство их не обладает подвижностью. Роды распадаются на подгруппы – аэробные, факультативно анаэробные и строго анаэробные. Другими удобными признаками для разделения родов служат расположение клеток и каталазная активность. Каталазоположительные кокки дифференцируют с помощью бензидиновой пробы, положительной у цитохромсодержащих микроорганизмов

Таблица
8. Отличительные признаки патогенных кокков

Признак	Staphylococcus	Micrococcus	Stomatococcus
Каталаза	+	+	±
Наличие капсулы	–*	–	+
Рост на среде с 5% NaCI	+	+	–
Способность к анаэробному росту на среде с глюкозой	+	–	+
Чувствительность к лизостафину	+	–	–
Чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД)	–	+	+

* – Подавляющее большинство видов

Микроорганизмы рода Staphylococcus

Микроорганизмы данного рода представлены примерно 30 видами, которые по фенотипическим признакам условно подразделяются на 4 группы. Cтафилококки — клетки сферические, повсеместно распространенные микроорганизмы, некоторые виды вызывают инфекционные заболевания у человека и животных.

Первых представителей рода выделил в 1880 Л. Пастер из гноя фурункула, в 1881 г. А. Огстон дал ему название Staphylococcus. В 1884 из очагов гнойных поражений человека Ф. Розенбах выделил виды S. albus, S. aureus. Данные микроорганизмы в основном ассоциированы с кожными покровами и слизистыми оболочками теплокровных. Но их выделяют и из пищевых продуктов и воды, что обусловливает пищевые токсикозы и токсикоинфекции.

Род образуют неподвижные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, располагающиеся в мазках одиночно, парами или гроздьями, что обусловлено способностью делиться во взаимно перпендикулярных плоскостях. Стафилококки неподвижны; факультативные анаэробы; хемоорганотрофы с окислительным и ферментативным метаболизмом, каталазоположительны; содержат цитохромы, но обычно оксидазоотрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима (Schleifer, Kloos), это обусловлено лабильностью пентаглициновых мостиков, соединяющих мурамовую кислоту и тетрапептиды в пептидогликанах клеточной стенки.

Растут на средах содержащих до10% NaCI, температурный оптимум роста — 30-37°С; предпочтительна слабощелочная реакция среды. На плотных средах образуют мутные круглые ровные колонии кремового, желтого или оранжевого цвета. Цвет колоний обусловлен наличием липохромного пигмента, его образование происходит только в присутствии кислорода и наиболее выражено на средах, содержащих кровь, углеводы или молоко. Вызывают характерное разжижение желатина с образованием воронки, заполненной жидкостью (на 4-5 сут.) На жидких средах дают равномерное помутнение, а затем рыхлый осадок, превращающийся в тягучую массу. Восстанавливают нитраты, образуют Н2
S, разлагают глюкозу, ксилозу, сахарозу, мальто­зу, глицерин, маннит с выделением кислоты; уреаза-положительны; крахмал не гидролизуют; индол не образуют. Видоспецифичными Аг являются тейхоевые кислоты; для S.aureus – рибиттейхоевые, для S.еpidermidis — глицеринтейхоевые; у S.saprophyticus выявляют оба типа кислот. Типовой вид — S. aureus. Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя вирулентность; погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10-12 ч. Довольно устойчивы к нагреванию — при 70-80°С погибают за 20-30 минут, при 150°С — за 10 минут; сухой жар убивает их за 2 ч. Менее устойчивы к действию дезинфектантов, но резистентны к воздействию чистого этанола. 14 из 27 известных видов обнаружены на коже и слизистых оболочках (S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis, S. haemolyticus, S. warneri, S. capitis, S. saccharolyticus, S. auricularis, S. simulans, S. cohni, S. xylosus, S. lugdunenis и S. schleiferi); большинство из них лучше растет в аэробных условиях (исключая S.saccharolyticus, предпочитающих анаэробные условия). По наличию коагулазы все стафилококки разделяют на две группы; среди патогенных видов коагулаза-положителен лишь S. aureus. остальные виды называют коагулаза-отрицательными. Основные поражения вызывают S. aureus, S. epidermidis и S. saprophyticus.

Staphylococcus aureus

Распространение. Золотистый стафилококк распространен повсеместно и часто входит в состав нормальной микрофлоры макроорганизма. Микроорганизм выделяют у 15-30% клинически здоровых взрослых людей. В большинстве случаев носительство ограничено несколькими неделями или месяцами; хроническое носительство типично для персонала медицинских учреждений; пациентов, страдающих атопическими дерматитами, а также регулярно использующих инъекции различных препаратов (наркоманы, больные сахарным диабетом, лица с повторными гемодиализами и др.). Подавляющее число инфекций носит эндогенный характер, механизм инфицирования обычно связан с переносом возбудителя из участков колонизации на травматизированную поверхность (например, кожные покровы); существенную роль играют также тесные контакты с носителями и лицами, страдающими стафилококковыми поражениями.

Патогенез поражений

Факторами патогенности являются микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты и токсические субстанции.

Микрокапсула защищает бактерии от комплемент-опосредованного поглощения полиморфноядерными фагоцитами, способствует адгезии микроорганизмов и их распространению по тканям. При выращивании in vitro обычно не образуется.

Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций: усиливают синтез ИЛ-1 макрофагами, активируют систему комплемента и являются мощными хемоаттрактантами для нейтрофилов. Тейхоевые кислоты запускают комплементарный каскад по альтернативному пути, активируют свертывающую и калликреин-кининовую системы, а также облегчают адгезию к эпителиальным поверхностям. Белок А (агглютиноген А) неспецифически связывает Fc-фрагменты молекул IgG (что активирует компоненты комплемента по классическому и альтернативному пути) и усиливает активность естественных киллеров. Активация комплемента приводит к проявлению различных местных и системных реакции, например анафилаксии, феномена Артюса, угнетению активности фагоцитов и т.д.

Ферменты проявляют разнонаправленное действие: каталаза защищает бактерии от действия О2
-зависимых микробицидных механизмов фагоцитов; b-лактамаза разрушает молекулы b-лактамных антибиотиков; липазы облегчают адгезию и проникновение в ткани. Коагулаза, существующая в 3 антигенных формах, вызывает свертывание сыворотки; сам фермент не взаимодействует с фибриногеном, а образует тромбиноподобное вещество, предположительно взаимодействующее с протромбином.

Гемолизины. Выделяют 4 антигенных типа гемолизинов, вызывающих полный гемолиз кровяных сред; золотистые стафилококки способны одновременно синтезировать несколько подобных продуктов.

a-Гемолизин (a-токсин) наиболее часто выявляют у бактерий, выделенных из клини­ческих образцов; неактивен в отношении эритроцитов человека, но быстро лизирует эритроциты барана. При введении подопытным животным вызывает кожные некроти­ческие реакции и гибель животных после внутривенного введения.

b-Гемолизин (сфингомиелиназа) оказывает умеренное действие на эритроциты чело­века, выявляют у 20% изолятов. Проявляет выраженные свойства холодового гемолизина (максимальная активность проявляется при низких температурах).

g-Гемолизин — двухкомпонентный гемолизин с умеренной активностью в отноше­нии эритроцитов человека, поскольку один из компонентов инактивируют содержа­щие серу полимеры, присутствующие в агаре, то эффект этого гемолизина на кровя­ных средах обычно не проявляется.

d-Гемолизин — агрегат низкомолекулярных соединений, проявляющих детергентные свойства, последние обусловливают цитотоксичность широкого спектра.

Токсины. Наибольшее значение имеют: эксфолиатины А и В, обусловливающие раз­витие синдрома «ошпаренной кожи»; токсин синдрома токсического шока (TSST-1), ответственный за развитие специфического симптомокомплекса (предположительно за счет стимулирования выделения фактора некроза опухолей); d-токсин (лейкоцидин), ингибирующий всасывание воды и активирующий образование цАМФ (что имеет значе­ние при стафилококковых диареях), а также оказывающий цитотоксическое действие на полиморфноядерные лейкоциты, энтеротоксины A-F, ответственные за развитие пищевых интоксикаций (энтеротоксины В и С также приводят к развитию синдрома токсического шока).

Лабораторная диагностика

Включает выделение возбудителя из образцов.

Рост. Через 24 ч S.аureus образует гладкие выпуклые мутные колонии обычно желтоватого цвета около 4 мм в диаметре (бактерии вырабатывают желтый пигмент, и цвет колонии варьирует от белого до оранжевого); наиболее интенсивно пигмент образуется на агаре, дополненном 10% снятого молока. На кровяном агаре они окружены зоной полно­го гемолиза.

Рисунок 5. Принципиальная схема выделения стафилококков

Иногда, особенно на бедных средах, лишенных необходимых ростовых фак­торов (гемин, тиамин, пантотенат и др.), может формировать карликовые G-колонии (ме­нее 1% изолятов), лишенные зон гемолиза и часто растущие в виде сателлитных колоний вокруг других бактерий в смешанных культурах. Также следует помнить о способности стафилококков образовывать полиморфные L-формы, для возврата к исходным формам проводят посев на тиогликолевую среду Хорошо растут на бульоне, образуя сначала равномерное помутнение, а затем рыхлый хлопьевидный осадок. Дают весьма характер­ный рост на желатине: через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по уколу) можно наблюдать начальное разжижение среды, а на 4-5 сутки образуется направленная вниз воронка, наполненная жидкостью.

Дифференцировка. Применяют коагулазный тест на наличие свертывающего фактора, положительный для 95% изолятов (желательно исследовать наличие свободного и связанного с клетками фермента), а также определяют способность ферментировать маннит; исследуют способность синтезировать термостабильную ДНКазу и агглютинировать частицы латекса или сенсибилизированные эритроциты барана. Последний тест позволяет выявлять белок А и свертывающий фак­тор, либо оба продукта. Следует помнить о возможных ложноположительных результатах при наличии S. epidermidis и микрококков, а также ложноотрицательных, обычных для метициллин (оксациллин) резистентных штаммов S. aureus (MRSA). В редких случаях инфекций, вызванных S. intermedius (обычно после укусов собак), также выделяют коагулаза-положительные стафилококки, отличающиеся от S. aureus способностью синтезировать пироглютамил-b-нафтиламидаминопептидазу

Серологические исследования (например, идентификация AT к тейхоевым кислотам) не имеют принципиального значения, а результаты часто носят противоречивый харак­тер. До настоящего времени реагенты для идентификации TSST-1 и AT к нему остаются недоступными.

Идентификация с помощью типовых бактериофагов. Метод типирования пато­генных стафилококков бактериофагами достаточно широко применяют в клинической эпидемиологии. Для фаготипирования используют стандартный набор из 20 бактериофа­гов, разделенных на 4 группы: 1-я группа включает фаги 29, 52, 52А, 79, 80, 2-я — 3А, 3С, 55, 71, 3-я — 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85, 4-я — 42D. С помощью соответству­ющих бактериофагов удается типировать 60-80% изолятов: установлены особые штаммы (например, фаготипов 80 и 77), наиболее часто выделяемые при вспышках.

При проведения лечения необходимо исследование чувствительности возбудителя к различном антибиотикам Значительная часть изолятов продуцирует b-лактамазу, либо ее синтез инду­цируют b-лактамные антибиотики; исследование проводят методом Кирби-Бауэра или се­рийных разведений. Важное значение имеет типирование штаммов бактериофагами (22 фага стандартного набора) либо изучение плазмидного профиля S. aureus, обеспечивающего устойчивость к антибиотикам.

Большие (2´107
Д) плазмиды кодируют образование b-лактамаз и резистентность к эритромицину. Мелкие (3´106
Д) плазмиды кодируют резистентность к тетрациклинам и хлорамфениколу (левомицетину)

В отличие от грамотрицательных бактерий, образование золотистым стафилококком b-лактамаз и хлорамфениколтрансфераз - индуцибельный процесс, т.е. они образуются только в присутствии антибиотиков.

S. epidermidis

Распространение. Наиболее часто колонизирует гладкую кожу и поверхность слизистых обо­лочек; микроорганизм характеризуется слабой вирулентностью, подавляющее большинство инфекций носит нозокомиальный характер, их чаще наблюдают у пациентов с пониженной резистентностью. Типичными для эпидермального стафилококка считают пораже­ния, обусловленные инфицированием различных устройств (протезов, катетеров, дренажей) либо гематогенным диссеминированием возбудителя после хирургических вмешательств. Важнейшими факторами вирулентности считают гидрофобные свойства поверхности, облегчающие адгезию к субстратам, и поверхностный полисахаридный слизистый слой, предохраняющий бактерию от действия микробицидных и цитотоксических защитных механизмов. Подобно поражениям, вызываемым S. aureus, важное патогенетическое значение имеют компоненты клеточной стенки S. epidermidis, стимулирующие развитие воспалительных реакций и оказывающие многостороннее действие на ткани. Диагностика поражений включает выделение возбудителя по стандартной схеме.

Микроорганизм не проявляет гемолитическую активность и на кровяном агаре образует беловатые гладкие выпуклые колонии. Основным методом дифференцировки от S. aureus считают определение коагулазной активности.

Выделенный коагулазоотрицательный стафилококк следует дифференцировать от микрокок­ков, чаще образующих желтые негемолизирующие колонии, и от прочих стафи­лококков, выделяемых из мочи (например, S. saprophyticus, S. cohni, S. lenthus, S. sciuri и S. xylosus) по нечувствительности к новобиоцину, к которому S. epidermidis чувствителен.

S. saprophyticus

Колонизирует кожные покровы гениталий и слизистую оболочку уретры; укреплению и росту на эпителии мочевыводящих путей способствуют олигосахаридные поверхностные рецепторы, а также способность к выделению ферментативного комплекса, подавляющего рост прочих бактерий. Выделение проводят по стандартной схеме, идентификацию — по чувствительности к новобиоцину, бацитрацину (чувствителен) и некоторым особенностям физиологии и метаболизма (табл. 9).

Питательные среды для культивирования стафилококков

Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.

Таблица
9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение

Признак	S. aureus		S. epidermidis	S. saprophyticus
	Anaerobius	Aureus
Наличие каротиноидного сегмента	–	±	–	+
Способность к росту в анаэробных условиях (тиогликолевая среда)	+	+	+	±
Рост на средах с 10% NaCI	+	+	± (слабо)	+
Рост при:
15°С	?	+	– (слабо)	+
45°С	–	+	+	±
Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях:
ксилоза	–	–	–	–
арабиноза	–	–	–	–
раффиноза	–	–	–	–
сахароза	+	+	+	+
маннит	–	+	–	±
манноза	–	+	±	–
трегалоза	–	+	–	+
лактоза	–	+	±	±
галактоза	–	+	±	–
фруктоза	+	+	+	+
ксилит	–	–	–	±
Восстановление нитратов	–	+	+ (слабо)	–
Щелочная фосфатаза	+	+	+	–
Гиалуронидаза	+	+	+	?
Уреаза	?	±	+	+
Коагулаза (на сыворотке кролика)	+	+	–	–
Фибринолизин	?	±	±	?
Гемолитическая активность	+	+	– (слабо)	–
ДНКаза	+	+	– (слабо)	–
Чувствительность к новобиоцину (МИК >1,6 мкг/мл)	+	+	+	–

С целью дифференциации патогенных стафилококков от сапрофитных, а также от микрококков, используют среды, позволяющие одновременно определить один из признаков, характеризующих патоген­ные стафилококки. Приводим рецепты некоторых питательных сред.

Молочно-солевой агар

В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 минут. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5% хлорида натрия.

Лактозо-солевой бульон с фенолротом

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 минут. При росте коагулазоположигельных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).

Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 минут при 121°С. Перед использова­нием в среду добавляют 100 мл 30%-ной желточной эмульсии (на фи­зиологическом растворе), 0,4 мл стерилизованного фильтрацией 1%-ного водного раствора полимиксина М, 10 мл стерилизованного автоклавированием (121°С 15 мин) 1%-ного водного раствора теллурита натрия.

Среда Джиолиотта и Кантони

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экст­ракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115°С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 мл 1%-ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтра­цией, При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.

Среда Бэрда-Паркера

К 90 мл основной среды с температурой 45°С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4°С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтра­цией; распределяют по поверхности, подсушивают. Колонии коагула­зоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.

Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001%-ном растворе HgCl2
. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора.

Глициновый раствор. Глицин — 20 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют при 120°С 15 минут.

Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют фильтрацией.

Желточно-солевой агар Чистовича

В расплавленный МПА с 10% хлорида натрия (рН 7,2), охлажденный до температуры 60°С, добавляют желточную эмульсию. После тщательного перемешивания питательную среду разливают в чашки Петри.

Среда Чаплина-Бернса

К 100 мл МПА добавляют 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием (110°С 30 минут). Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.

Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)

Вариант 1: пептон — 1%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, дрожжевой экстракт — 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый ка­лий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Среду стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).

Вариант 2: пептон — 1%, дрожжевой экстракт — 0, 25%, желатин — 3%, лактоза — 0,2%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, двузамещен­ный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0.

Микроорганизмы рода Streptococcus

Микроорганизмы указанного рода, по данным определителя бактерий Берджи, обладают не ясным до конца систематическим положением. В частности, в данный род в настоящее время объеденены энтерококки, молочнокислые стрептококки, стрептококки ротовой полости, пиогенные и анаэробные стрептококки. Однако в предлагаемом учебном пособии мы будем придерживаться традиционной систематики указанной группы кокков.

Стрептококки впервые обнаружены в тканях человека при рожистом воспалении и раневых инфекциях (Бильрот, 1874), септицемиях и гнойных поражениях (Пастер, 1879, Огстон, 1881); в чистой культуре их выделили Феляйзен (1883) и Розенбах (1884). Род образуют сферические или овоидные микроорганизмы, размером 0,5-2,0 мкм, в мазках располагаются парами или короткими цепочками (особенно при выращивании на жидких средах) под различными воздействиями могут приобретать вытянутую или ланцетовидную форму, напоминая коккобациллы. Непо­движны, спор не образуют; некоторые виды имеют капсулу. Хемоорганотрофы, метабо­лизм бродильный, виды, играющие роль в патологическом процессе, ферментируют глюкозу с образованием молочной кислоты. Каталазоотрицательны; большинство видов проявляет гемолитическую активность. Факультативные анаэробы; предпочтительно содержание 5% СО2
; некоторые – микроаэрофилы, предпочитают анаэробные условия. Растут в интервале 25-45°С, температурный оптимум роста 37°С. Паразиты млекопитающих; типовой вид – S.pyogenes. По предложению Ребекки Лэнсфилд (1933) стрептококки классифицируют по наличию специфических углеводов в клеточной стенке, выделяют 17 серогрупп, обозначаемых заглавными латинскими буквами (по специфичности белковых Аг М, Р, и Т стрептококки внутри групп разделяют на серовары) Также используют классификацию Брауна (1919), основанную на особенностях роста на агаре с кровью барана. Соответственно выделяют a- (дают частичный гемолиз и позеленение среды), b- (полностью гемолизирующие) и g- (дающие визуально невидимый гемолиз) стрептококки, основными возбудителями болезней человека являются b-гемолитические виды, большая часть которых относится к серогруппе А.

Стрептококки группы А.

Большинство изолятов принадлежит к виду S. pyogenes, оба термина рассматривают как синонимы. Микроорганизмы известны с глубокой древности, но своего пика заболеваемость достигла в XIX веке. На этот период приходятся известные эпидемии скарлатины, часто осложнявшейся абсцессами паратонзиллярных пространств, клетчатки подъя­зычного, поднижнечелюстного пространств, многочислен­ные случаи фарингитов, нередко заканчивавшихся пневмониями, ревматизмом и острым гломерулонефритом. Также широко распространились инфекции кожи и мягких тканей — от стрептококкового импетиго до рожи, часто заканчивавшейся фатально. Последняя была неиз­бежным спутником войн и, по словам американского историка Д. Макферсона, «косила севе­рян и южан» во время Гражданской войны. Не менее драматична история послеродового сепси­са, печально известной родильной горячки, жертвой которой стали сотни тысяч матерей, а также пионер борьбы с этим недугом — Земмельвайс, жестоко поплатившийся за свои воззре­ния. Следует отметить, что стрептококковые поражения дают подъем заболеваемости и в насто­ящее время даже во вполне благополучных странах [например, эпидемическая вспышка в Солт-ЛейкСити (штат Юта, США)] в 1985 г. Зарегистрированы относительно новые формы поражений, например стрептококковый токсический синдром, напоминающий аналогичное поражение, вызываемое стафилококками.

Распространение

Стрептококки группы А — убиквитарные (встречающиеся повсеместно) микроорганизмы, часто колонизирующие кожные покровы и слизистые оболочки, в частности, в холодный сезон частота носительства в носоглотке у школьников может достигать 25%. Резервуар — больной или носитель, основные пути передачи — контактный (с заносом в рот грязными руками) и воздушно-капельный, а также через инфицированные пищевые продукты, хранящиеся при комнатной температуре (напри­мер, молоко).

Патогенез поражений

Сложен, многие его звенья изучены плохо. Первым этапом инфек­ционного процесса является адгезия микроорганизма к эпителию слизистых оболочек; эффективность адгезии снижает вероятность элиминации с секретом и обеспечивает воз­можность быстрой колонизации. Основным адгезином является липотейхоевая кислота, покрывающая поверхностные фимбрии.

Фимбриальный белок (или белок М) — основной фактор вирулентности и типоспецифический Аг; AT к нему обеспечивают длительную невосприимчивость к повторным зараже­ниям, однако выделяют более 80 серотипов белка М, что значительно снижает эффектив­ность гуморальных защитных реакций. Белок М препятствует реализации фагоцитарных реакций; связывает фибриноген, фибрин и продукты его деградации; адсорбирует их на своей поверхности, маскируя рецепто­ры для компонентов комплемента и опсонинов. Белок М проявляет свойства суперантигена, вызывая поликлональную активацию лимфоцитов и образование AT с низким аффините­том; подобные свойства играют суще­ственную роль в нарушении толерант­ности к собственным тканевым Аг и развитии аутоиммунопатологии.

Вторым по значимости фактором виру­лентности является капсула, защища­ющая стрептококки от антимикробного потенциала фагоцитов и облегчающая адгезию к эпителию; поскольку капсу­ла образована гиалуроновой кислотой, то она проявляет минимальную иммуногенную активность. Интерес представ­ляет способность бактерий самостоя­тельно разрушать капсулу при инвазии в ткани за счет синтеза гиалуроновой кислоты. Тем не менее, микроорганиз­мы, выделенные во время ревматичес­ких атак, обладали выраженной капсу­лой. Роль гиалуронидазы в патогенезе поражений остается плохо изученной; с одной стороны, она участвует в раз­рушении соединительнотканной стромы, с другой — имеет сходство со многими аутоантигенами и, возможно, участвует в запуске аутоиммунных реакций.

Третьим фактором, подавляющим ак­тивность фагоцитов, является С5а-пептидаза. Фермент расщепляет и инактивирует С5а компонент компле­мента, являющийся мощным хемоаттрактантом.

Перекрестные реакции. Несмотря на способность подавлять или снижать активность фагоцитов, стрептококки инициируют выраженную воспалительную реакцию, во многом обусловленную секрецией более 20 растворимых продуктов. Часть из них составляют ферменты (стрептолизины S и О, гиалуронидаза, ДНКазы, НАДазы и стрептокиназа), другую часть — эритрогенные токсины. Патогенез ревматических поражений, осо­бенно кардитов, существенно отличается от наблюдаемых при большинстве инфекций, сопровождаемых бактериемиями. Основные повреждения вызывают иммунные механиз­мы, в частности, перекрестная реакция с миокардиоцитами и белком М возбудителя. Весьма сходны механизмы повреждения почек при острых гломерулонефритах, обуслов­ленные депонированием иммунных комплексов (стрептококк – IgG) на базальной мембра­не, с одной стороны, они активируют комплементарный каскад, что стимулирует воспали­тельный ответ, с другой — за счет нарушения аутотолерантности и антигенной мимикрии индуцируют клеточные цитотоксические реакции.

Стрептолизин О чувствителен к кислороду; проявляет иммуногенные свойства и вызы­вает гемолиз эритроцитов в глубине кровяного агара; стрептолизин S резистентен к О2
, не несет антигенной нагрузки и вызывает поверхностный гемолиз на кровяных средах. Оба фермента разрушают не только эритроциты, но и другие клетки, в частности, проду­центы стрептолизина S способны уничтожать фагоциты, поглотившие их. Их роль в патогенезе поражений остается недостаточно изученной, но их активируют многие сыво­роточные агенты (например, фосфолипиды).

Эритрогенные (пирогенные) токсины весьма схожи с токсинами стафилококков, иммунологически разделяются на 3 типа (А, В и С); способность к образованию детерми­нирована инфекцией умеренным фагом. Проявляют пирогенную активность (за счет не­посредственного действия на гипоталамус), а также ведут к появлению обусловленных иммунными механизмами высыпаний на коже. Интерес представляет тот факт, что с XVII до середины XX века среди возбудителей скарлатины доминировал серотип А, открытый супругами Дик, а начиная с 70-х гг., преобладают поражения, вызываемые стрептококка­ми типов В и С. Тем не менее, бактерии-продуценты токсина А продолжают часто выяв­ляться при поражениях мягких тканей и синдромах токсического шока. Эритрогенные ток­сины проявляют суперантигенные свойства, оказывая митогенное действие на Т-клетки, а также стимулируют секрецию макрофагами ИЛ-1 и фактора некроза опухолей, являю­щихся медиаторами септического шока.

Кардиогепатический токсин продуцируют некоторые штаммы стрептококков группы А, токсин вызывает поражения миокарда и диафрагмы, а также образование гигантоклеточных гранулем в печени.

Среди прочих ферментов существенную роль в патогенезе поражений играют стрептоки­наза (активирует плазминоген, что приводит к образованию плазмина и растворению фибриновых волокон) и гиалуронидаза (облегчает перемещение бактерий по соединитель­ной ткани). Роль ДНКаз (стрептодорназа) и НАДаз неизвестна, но выявление AT к стрептодорназе В используют в диагностике различных осложнений, вызванных стрепто­кокками группы А. Медицинское применение нашла очищенная смесь стрептокиназы, стрептодорназы и других протеолитических ферментов стрептококков (стрептокиназа-стрептодорназа), используемая для рассасывания тромбов, фибринозных и гнойных экссудатов.

Лабораторная диагностика

«Золотым стандартом» считают выделение возбудителя (рис. 6), т.к. прочие методы диагностики имеют различные ограничения.

Через 24 ч. На кровяном агаре стрептококки группы А образуют колонии 3 типов: крупные, блестящие, вязкие, напоминающие каплю воды (характерны для свежевыделенных вирулентных изолятов, имеющих капсулу; наиболее часто образует S. рyogenes); серые, матовые, зернистые, с неровным краем (характерны для свежевыделенных вирулентных изолятов, имеющих М-Аг), выпуклые прозрачные колонии диаметром около 0,1-0,3 мм (характерны для авирулентных лабораторных штаммов). Колонии окружены зоной полного гемолиза (ее размеры в 2-4 раза превышают диаметр колонии). На жидких средах дают придонный, иногда поднимающийся вверх рост. В мазках выявляют типичные грамположительные кокки, образующие короткие цепочки, также можно обнаружить полиморфные формы, напоминающие коринебактерии или лактобациллы, либо грамотрицательные формы (из старых культур или от лиц, получавших антибиотики), также следует помнить о способности стрептококков образовывать L-формы. Для дифференцировки выделенные микроорганизмы засевают на тиогликолевую среду, полужидкий агар, вырос­шие стрептококки отличаются типичной морфологией. Также можно произвести посев на кровяной агар и нанести на его поверхность диск, пропитанный пенициллином (10 ЕД), через 24 ч исследуют мазки из колоний (стрептококки принимают сферическую форму, а лактобациллы сохраняют вытянутую форму). Более 99% изолятов чувствительны к бацитрацину и гидролизуют пирролидонил-р-нафтиламид (ПИР-тест). Стрептококки груп­пы А также можно легко выявить в мазках из зева, используя коммерческие наборы; групповой А-Аг экстрагируют химическими реагентами или ферментами и идентифициру­ют в реакциях латекс-агглютинации, коагглютинации или ИФА.

Для экспресс-диагностики ревматической лихорадки и гломерулонефрита можно опреде­лять AT к стрептолизину О или стрептодорназе; серологические исследования также позволяют выявлять носителей. Следует помнить, что AT к стрептолизину О не образу­ются при кожных инфекциях, вызываемых стрептококками группы А.

Рисунок
6. Принципиальная схема бактериологического выделения стрептококков группы А

Стрептококки группы В

Колонизируют носоглотку, ЖКТ и влагалище; значительная часть изолятов идентифицирована как S. agalactiae. Его основным резервуаром считают ЖКТ. Серологи­чески стрептококки группы В разделяют на серовары la, Ib, Ic, II и III, бактерии сероваров Iа и III тропны к тканям ЦНС и дыхательных путей и наиболее часто вызывают менингиты у новорожденных. Вертикальный путь заражения — прохождение плода по родовым путям, инфицированным стрептококками; подобным образом инфицируются не менее 50% детей, со­ставляющих группу риска. У детей, родившихся у матерей со значительной колонизацией родо­вых путей, чаще наблюдают раннее развитие менингита (в течение первых 5 суток), а у детей, инфицированных большой дозой, подобные поражения наблюдают позднее (от 6 суток до 3 месяцев). Факторами, предрасполагающими к ранним проявлениям, считают затяжные роды (более 24 ч), раннее вскрытие плодного пузыря, наличие эндометритов и амнионитов; на тяжесть заболева­ния влияет содержание специфических AT, полученных от матери. Горизонтальную передачу возбудителя наблюдают значительно реже. Тем не менее стрептококки группы В также вызыва­ют достаточно разнообразные поражения, большинство из которых обусловлено проникновени­ем в кровоток. Особо необходимо отметить стрептококковые пневмонии, разви­вающиеся на фоне респираторных вирусных инфекций; «чистые» бактериальные поражения наблюдают редко, но как осложнения ОРВИ пневмонии отмечают так часто, что создается впечатление, что сами стрептококки группы В не способны вызывать поражения легких. В подавляющем большинстве эти инфекции обусловлены активацией микрофлоры в зеве и носог­лотке, реже регистрируют заражение от больного вирусами в ассоциации с высоковирулентными стрептококками. Несмотря на то, что подобные пневмонии вызывают различные виды микро­организмов, имеются данные, свидетельствующие о прямой связи между вирусами и стрептококками группы В; так, летальный синергизм с вирусом гриппа известен еще с 30-х гг. Массовое заражение респираторными вирусами увеличивает чувствительность легочной ткани к бактериальным суперинфекциям уже через несколько часов после проникновения первичного инфекционного агента.

Патогенез поражений, вызванных гематогенной диссеминацией возбудителя, во многом обусловлен дефицитом специфических AT, Clq и С4 компонентов комплемента (низкие уровни последних коррелируют с низкой бактерицидной активностью в целом). Определенную роль играет полисахаридная капсула, снижающая эффективность фагоцитарных реакций. Последняя, в отличие от стрептококков группы А, проявляет иммуногенные свойства, и АТ к ее Аг (в достаточном количестве) способны оказывать протективное действие. Однако иммунизация беременных не обеспечивает образования достаточных титров AT. Как патоге­нетический фактор следует рассматривать и нейраминидазу, модифицирующую мембрану клеток хозяина, что облегчает адгезию микроорганизмов, первичного звена бактериальной агрессии. Скорость заселения дыхательных путей стрептококками группы В указывает не столько на дефекты в функционировании систем защиты, сколько на повышение чувстви­тельности легочной ткани.

Развитие экссудативного воспаления в зонах газообмена создает условия для размножения микро­организмов, размножение вируса в эпителии тормозит метаболизм клеток, вследствие чего они экспрессируют дефектные рецепторы, нейраминидаза вирусов (например, гриппа) и стрептококков изменяет структуру гликопротеиновых рецепторов клеток и повышает тем самым прочность связи с микробными лигандами.

Синергизм вирусно-бактериальных поражений носит двусторонний характер, известно, что неко­торые штаммы бактерий, способные синтезировать протеазы, активируют вирулентность вируса гриппа за счет расщепления гемагглютинина и стимулируют множественные репродуктивные циклы возбудителя.

Поражения, вызванные стрептококками группы В, отмечают во всех возрастных категориях, но, безусловно, доминирует патология новорожденных. У 30% детей с ранними проявлениями наблюдают бактериемии (без конкретного очага пер­вичного инфицирования), у 32-35% — пневмонии, а у остальных — менингиты, развиваю­щиеся у 50% в течение 24 часов. Заболевания новорожденных протекают тяжело, смертность достигает 37%. У детей с поздними проявлениями наблюдают менингиты и бактериемии; 10-20% детей погибают, а у 50% выживших наблюдают остаточные нарушения. У рожениц стрептококки группы В вызывают послеродовые инфекции: эндометриты, поражения мочевыводящих путей и осложнения хирургических ран при кесаревом сечении. Также отмечают способность микроорганизмов вызывать поражения кожных покровов и мягких тканей, пневмонии, эндокардиты и менингиты у взрослых. Бактериемии также наблюдают у лиц старшего возраста, страдающих сахарным диабетом, заболеваниями периферических сосудов, пече­ни и злокачественными новообразованиями.

Лабораторная диагностика. Принципы бактериологической идентификации аналогичны подходам к выделению стрептококков группы А (рис. 6).

Колонии, выросшие на кровяном агаре, через 24 ч прозрачные или мутноватые, выпук­лые, диаметром 0,5-1,0 мм, окружены зоной гемолиза; 5-15% изолятов может не прояв­лять гемолитических свойств. При выделении атипичных форм прибегают к посеву на тиогликолевую среду, полужидкий агар, агар с глюкозой либо проводят пересев на кровя­ной агар и используют диски с пенициллином (аналогично манипуляциям с атипичньми формами стрептококков группы А).

Стрептококки группы В обычно нечувствительны к бацитрацину, разлагают гиппурат и положительны в САМР-тесте. Дальнейшую идентификацию проводят серотипированием в реакции латекс-агглютинации или коагглютинации с коммерческими ре­агентами либо с помощью инкубации мазков с моноклональными AT, меченными флюоресцеинами Микроорганизмы можно быстро идентифицировать в мазках отделяемого влагалища, используя коммерческие наборы, аналогичные применяемым для выявления стрептококков группы А.

S. pneumoniae (пневмококк)

Не содержит группового Аг и серологически неоднороден, по Аг капсульных полисахаридов выделяют 84 серовара, известны штаммы, колонизирующие организм человека и животных. Впервые S. pneumoniae выделил Пастер (1881) во время работы над антирабической вакциной; этиологическую роль в развитии пневмонии у человека доказали Френкель и Вайхзельбаум (1884).

Распространение

Пневмококк — один из основных возбудителей бактериальных пневмоний, регистрируемых вне стационаров (2-4 случая на 1000 человек), ежегодно в мире наблюдают не менее 500 000 случаев пневмококковых пневмоний людей (реальная величина значительно больше). Наиболее подвержены инфекции дети и лица преклонного возраста. Резервуар инфекции — больные и носители (20-50% детей дошкольного возраста и 20-25% взрослых лиц), основной путь передачи — контактный, в период вспышек также воздушно-капельный. Пик заболеваемости приходится на холодное время года. В подавляющем большинстве случаев клинические формы инфекции развиваются при нарушениях резистентности организма.

Морфология и культуральные свойства

Овальные или ланцетовидные кокки диаметром около 1 мкм, в мазках из клинического материала располагаются парами, каждая из которых окружена толстой капсулой, на питательных средах могут располагаться цепочками и быть более округлыми. На простых средах образуют тонкую капсулу, ее развитие стимулирует внесение крови, сыворотки или асцитической жидкости. Неподвижны, спор не образуют; аэробы или факультативные анаэробы, при культивировании предпочтительны капнофильные условия (5-10% СО2
). Хорошо растут на кровяных или сывороточных средах, дополненных 0,1% глюкозой, температурный оптимум — 37°С; оптимум рН 7,8. На жидких средах дают равномерное помутнение и небольшой хлопьевидный осадок, при длительном культивировании осадок увеличивается. На агаре образуют нежные. полупрозрачные, четко очерченные колонии диаметром около 1 мм, иногда они могут быть плоскими с центральным углублением, подобно прочим стрептококкам, колонии никогда не сливаются между собой. На кровяном агаре колонии окружает зона a-гемолиза в виде зеленоватой обесцвеченной зоны.

Патогенез поражений

Патогенез большинства пневмоний включает аспирацию слюны, содержащей S. pneumoniae, и проникновение бактерий в нижние отделы воздухоносных путей. Существенное значение имеет нарушение защитных дренирующих механизмов — кашлевого толчка и мукоцилиарного клиренса. У взрослых чаще наблюдают долевые поражения легких, у детей и лиц преклонного возраста доминируют перибронхиальные или очаговые поражения. Основной фактор вирулентности — капсула (как типоспецифический Аг опосредует дифференцировку пневмококков на серовары), защищающая бактерии от микробоцидного потенциала фагоцитов и уводящая их от действия опсонинов Некапсулированные штаммы практически авирулентны и встречаются редко. Большую часть пула противопневмококковых AT составляют AT к Аг капсулы. Важное значение имеет суб­станция С – холинсодержащая тейхоевая кислота клеточной стенки, специфически взаимодействующая с С-реактивным белком. Следствием подобного реагирования являются активация комплементарного каскада и высвобождение медиаторов острой фазы воспаления, их аккумуляция в легочной ткани стимулирует миграцию полиморфноядерных фагоцитов. Формирование мощных воспалительных инфильтратов сопровождается нарушением гомеостаза легочной ткани и ее опеченением. Инфекции наиболее вирулентным сероваром 3 могут сопровождаться образованием полостей в паренхиме легких. Из первичного очага возбудитель может проникать в плевральную полость и перикард, либо диссеминировать и вызвать менингиты, эндокардиты и суставные поражения.

Клинические проявления

Классическая пневмококковая пневмония начинается внезапно, отмечают подъем температуры тела, продуктивный кашель и боли в груди. У слабых заболевание развивается медленно, с незначительной лихорадкой, нарушением сознания и признаками легочно-сердечной недостаточности. Стрептококковые менингиты регистрируют во всех возрастных группах, они характеризуются бурным началом с подъемом температуры тела, ригидностью шейных мышц, головной болью, тошнотой и рвотой. Поражения сосудов мозговых оболочек часто сопровождаются потерей сознания, среди детей и в преклонном возрасте летальность может достигать 80%.

Лабораторная диагностика

«Золотым стандартом» является выделение возбудителя (рис. 7). Следует помнить, что материал необходимо исследовать быстро, т. к. бактерии склонны к быстрому аутолизу, обусловленному активностью внутриклеточных ферментов. На пневмококковую инфекцию указывает наличие нейтрофилов и грамположительных лан­цетовидных диплококков (не менее 10 в поле зрения) в мазках клинического материала. В противном случае прибегают к выделению возбудителя.

1. Для дифференцировки от прочих стрептококков используется проба с оптохином (угне­тает их рост); от зеленящих стрептококков возбудитель отличают способность ферменти­ровать инулин, а также чувствительность к желчи (дезоксихолатная проба).

2. Изоляты, выделенные из полостей (например, при менингитах), следует серотипировать, используя коммерческие реагенты для реакции латекс-агглютинации или коагглютинации, выявляющих капсульные Аг.

3. При сомнительных результатах можно внутрибрюшинно заразить белых мышей материа­лом от больного, а затем провести бактериологические и серологические исследования перитонеального экссудата.

Рисунок 7. Принципиальная схема бактериологического выделения пневмококков

Негемолитические стрептококки

Составляют гетерогенную группу бактерий, дающих неполный (a) гемолиз (исключая некоторые изоляты S. anginosus). Поскольку они вызывают позеленение кровяных сред, их также обозначают как зеленящие стрептококки. Они не взаимодействуют с групповыми антисыворотками по Лэнсфилд (b-гемолитические штаммы S. anginosus реагируют с антисыворотками к группам А, С, F и G, a S. bovis — к группе D). Зеленящие стрептококки входят в состав микробных ценозов ротовой полости (составляют 30-60% всей микрофлоры) и кишечника, но также способны вызывать инфекционные поражения при проникновении в обычно стерильные полости.

Патогенез

Микроорганизмы отличает низкая вирулент­ность, и вызываемые ими системные поражения можно в определенной степени рассматри­вать как оппортунистические.

а. Основную их часть составляют бактериальные эндокардиты, развивающиеся после проникновения бактерий в кровоток при травматизации слизистых оболочек (например, после пережевывания грубой пищи). Следует отметить, что эндокардиты, вызываемые зеленящими стрептококками, носят злокачественный характер и сопровож­даются поражением сердечных клапанов (около 50% подобной патологии, вызываемой бактериями). Способность вызывать эндокардиты обусловлена особенностями структуры гликанов (декстранов) клеточной стенки, облегчающих адгезию стрептококков к агрегатам тромбоцитов и фибрина на поврежденных клапанах. Поражения характеризуются лихорадкой, потерей массы тела, потливостью, артралгиями и проявлениями эмболий периферических сосудов: в ЦНС их отмечают в 30% случаев, в селезенке — в 40%.

б. Второй по значимости, но несравненно более частой патологией является кариозное поражение зубов, вызываемое зеленящими стрептококками биогруппы mutans. Микро­организмы содержат поверхностный белок, связывающий гликопротеины слюны на поверхности зубов, и (совместно с другими бактериями) образуют бактериальные бляшки на зубах. Они превращают сахарозу, поступающую с пищей, в молочную кислоту, вызы­вающую деминерализацию эмали зубов. Следует отметить, что образовывать молочную кислоту из сахарозы способны многие микроорганизмы, обитающие в ротовой полости, но лишь стрептококки биогруппы mutans и лактобациллы способны к образованию мо­лочной кислоты при низких значениях рН, т. е. индуцировать развитие поражений.

Лабораторная диагностика

Помимо общих лабораторных исследований, включает выделе­ние возбудителя по стандартной схеме. На наличие возбудителей указывает появ­ление a-гемолизирующих или негемолизирующих колоний, S. anginosus образует мелкие (>0,5 мм) колонии, окруженные зоной a- или b-гемолиза. Дальнейшую дифференцировку про­водят по отсутствию способности расти на жидких средах с 6,5% NaCI (в отличие от энтеро­кокков), неспособности гидролизовать эскулин в присутствии солей желчных кислот (могут быть положительны 10% изолятов), отсутствию чувствительности к оптохину. Следует с осто­рожностью применять коммерческие наборы для видовой идентификации, т.к таксономия зеленящих стрептококков нуждается в доработке и постоянно совершенствуется. S. bovis можно идентифицировать с помощью антисыворотки к Аг стрептококков группы D

Прочие стрептококки

Стрептококки групп С и G являются членами микробных сооб­ществ верхних отделов дыхательных путей и ЖКТ многих млекопитающих, и спорадически колонизируют кожные покровы, зев, мочеполовую систему и кишечник. Систематика микроорганизмов нуждается в более детальной проработке. У человека наиболее часто выделя­ют S. equisimilis, S. dysgalactiae, S. zooepidermicus, S. equi и недифференцированные виды, обра­зующие крупные колонии; к этой группе также относятся некоторые изоляты S. anginosus, не проявляющие микроаэрофильных или анаэробных свойств. Эти виды в большей степени пато­генны для животных, но и у человека вызывают разнообразные поражения, хотя их регистрируют сравнительно редко. Поражения развиваются как при употреблении различных загрязненных животных продуктов, так и эндогенно, из имеющихся очагов. Патогенез пораже­ний аналогичен прочим стрептококковым инфекциям; основные факторы патогенности — гиалуронидаза, фибринолизины, стрептокиназа, стрептолизин О и эритрогенные токсины. Де­фектные (прихотливые) виды (S. defectivus, S. adjacens), требующие для роста внесения в среду пиридоксина (витамина В6
), вызывают редкие случаи эндокардитов, и их выделяют из гемокультур. Дифференцировку проводят на основании результатов реакций латекс-агглютинации и изу­чения биохимических особенностей.

Род Enterococcus образуют овальные бактерии размером 0,6-2,0´0,6-2,5 мкм, в мазках культур, выращенных на жидких средах, располагаются парами или короткими цепочками. Спор не образуют, некоторые виды ограниченно подвижны (имеют небольшие жгутики), капсул не имеют. Факультативные анаэробы; хемоорганотрофы (метаболизм ферментативный); расщепляют различные углеводы с образованием кислоты (преимущественно молочной) без газа. Пищевые потребности сложные, каталазоотрицательны, в редких случаях восстанавливают нитраты. Растут в интервале 10-45°С (оптимум 37°С). Типовой вид — E.faecalis. Широко распространены в природе, обитают в кишечнике различных позвоночных, вызывают нагноения ран, бактериемии и поражения мочевыводящей системы. Ранее микроорганизмы систематизировали как стрептококки группы D (некоторые также реагируют с антисыворотками к группе Q). У человека наиболее часто поражения вызывают E.faecalis, E.faecium и Е. durans; их отличительные признаки приведены в таблице 10.

Таблица 10. Основные отличительные признаки энтерококков, патогенных для человека

Признак	Е. durans	Е . faecalis	Е . faecium
Подвижность	–	± (11–20% изолятов)	± (11–20% изолятов)
Рост при 45°С	+	+	+
Рост при 50°С	–	± (11–20% изолятов)	+ (80–89% изолятов)
Рост на средах, содержащих:
6,5% NaCI	+	+	+
0,04% теллурита	–	+	–
молоко с 0,1% метиленовым синим	+	+	?
Образование желтого пигмента	–	–	–
Гемолиз	a, b	Иногда a	Иногда b
Гидролиз гиппурата	±	±	+ (80–89% изолятов)
Образование кислоты из:
Рамнозы	–	±	–
Сахарозы	–	+	±
Арабинозы	–	–	+
Глицерина	–	+	+
Сорбита	–	+ (80–89% изолятов)	–
Маннита	± (11–20% изолятов)	+	+ (80–89% изолятов)
Серологическая группа по Лэнсфилд	D	D	D

Распространение

Энтерококки входят в состав микрофлоры ротовой полости, кишечника и мочеполовой системы; так, E. faecium выделяют из испражнений у 25% клинически здоровых лиц. Большинство инфекций, вызванных энтерококками, носит эндогенный характер и обусловлено инвазией микроорганизмов при избыточной колонизации; также показана возможность нозокомиальной передачи микроорганизмов, частота подобных инфекций возрастает на фоне высокой частоты применения цефалоспоринов широкого спектра действия.

Клинические проявления

Энтерококки часто вызывают поражения мочеполовой системы. Также они вызывают 10-20% всех бактериальных эндокардитов и 5% бактериемий. Эндокардиты характеризуются вялым подострым течением с постепенным развитием клапанной недостаточности. Бактериемии могут развиваться как следствие поражений мочевой системы или внутрибрюшинных абсцессов; в 40% случаев источник проникновения бактерий в кровоток остается неизвестным. Гемолизирующие энтерококки также способны вызывать пищевые отравления и дисбактериозы кишечника.

Лабораторная диагностика

Выделение возбудителя обычно не представляет трудностей (рис. 8), т.к. энтерококки хорошо растут на простых средах; на кровяном агаре могут давать зоны полного (редко) или неполного гемолиза. Через 24 ч энтерококки образуют сероватые колонии диаметром 0,4-1 мм; признаками, дифференцирующими их от зеленящих стрептококков, являются: способность расти на средах, содержащих 6,5% NaCI, а также способность изменять окраску лакмусового молока или молока с этиленовым синим через 4-6 ч при 37°С.

Рисунок 8. Принципиальная схема бактериологического выделения энтерококков

Питательные среды для культивирования стрептококков

Глюкозо-сывороточный бульон. К свежему стерильному МПБ (рН 7,4-7,6) добавляют 10% нормальной инактивированной сыво­ротки крови лошади и 1% глюкозы. Сыворотку и глюкозу предпо­чтительнее стерилизовать фильтрацией.

Глюкозо-кровяной агар. К расплавленному МПА с температурой около 45°С добавляют 1% глюкозы и 5—10% стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Приготовленный агар разли­вают в чашки Петри.

Среда Эдварда (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллирован­ной воды растворяют 10 г пептона, 10 г сухого мясного экстракта, 1 г эскулина, 5 г натрия хлорида, 0,0013 г кристаллвиолета, 0,33 г таллия сульфата и 15 г агара; устанавливают рН 7,4, Стерилизуют при 115° С 20 минут. К охлажденному до 45° С агару добавляют 5% стерильной дефибринированной крови овцы или крупного рогатого скота и разли­вают в чашки Петри. Среда обладает селективными свойствами. Используют для выде­ления S. agalactiae.

Кровяной агар с азидом натрия (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г триптозы, 3 г сухого мясного экстракта, 5 г натрия хлорида, 0,2 г азида натрия, 12 г агара; устанавливают рН 7,2, автоклавируют при 121°С 15 минут. К расплав­ленному агару с температурой 45°С добавляют 5% стерильной крови овцы, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда предназначена для выделения патогенных стрептококков из материалов, контаминированных посторонней микрофлорой. Азид натрия подавляет рост многих грамотрицательных бактерий.

Селективная среда с антибиотиками (пропись фирмы Oxoid, 1982). В расплавленную и охлажденную агаровую среду добавляют 7% дефибринированной крови барана и антибиотики (на 1000 мл среды): налидиксовой кислоты - 7,5 мг, полимиксина В - 17000 ЕД, неомицина (или неомицина сульфата) - 2,12 мг. Каждый антибиотик пред­варительно растворяют в 20 мл стерильной дистиллированной воды, Готовую среду используют в течение 48 ч при хранении в холодиль­нике (4-8°С). На среде ингибируется рост стафилококков, синегнойной палоч­ки, энтеробактерий, клебсиелл и предотвращается роение протея. Если после засева на поверхность среды положить полоски фильт­ровальной бумаги (диски), пропитанные бацитрацином (10 ЕД), то можно дифференцировать стрептококки серогруппы А (чувствитель­ные к бацитрацину) от (3-гемолитических стрептококков других групп, устойчивых к бацитрацину (Streatmer et al., 1962).

Молочная среда с полимиксином по Калине (для энтерококков). К 85 мл расплавленного МПА с температурой 45°С добавляют 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета, 0,5 мл 10%-ного вод­ного раствора 2,3,5-ТТХ, 15 мл стерильного обезжиренного молока, 20-40 ЕД/мл полимиксина М. Среда, разлитая в чашки Петри, пригод­на для использования в течение 7—10 дней при условии хранения в хо­лодильнике (4°С). Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5-2 мм, крас­новатую окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне.

Желчно-кровяной агар Беленького (для энтерококков). К 600 мл 3%-ного расплавленного МПА добавляют 400 мл нативной профиль­трованной желчи. Стерилизуют при 115°С 30 минут. К охлажденному до 45°С агару добавляют 5% дефибринированной крови и разливают по чашкам Петри. На среде растут энтерококки, но не растут гноерод­ные и оральные стрептококки.

Энтерококковая дифференциально-диагностическая среда. К 1000 мл расплавленного МПА, имеющего температуру 45-50°С, перед употреблением добавляют 0,1 г ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолийхлорид), 12,5 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета, 0,1 кислоты, 20% обезжиренного молока, 1% глюкозы, 5% стерильной дефибринированной крови. Компоненты перемешива­ют и разливают по чашкам Петри. ТТХ и налидиксовую кислоту предва­рительно растворяют в небольшом количестве МПБ. Колонии S. faecalis вишнево-красного цвета, S. faecium — бесцветные или белого.

Щелочно-полимиксиновая среда Г. П. Калины (для энтерококков). Готовят отдельно три раствора.

Раствор 1: 23 мл МПБ, 1 г глюкозы, 0,5 г натрия хлорида, 2 г дрожжевого экстракта.

Раствор 2: 25 мл дистиллированной воды, 0,53 г Nа2
СО3
.

Раствор 3: 25 мл дистиллированной воды, 0,25 г двухосновного фосфата калия. Смеси стерилизуют раздельно при 112°С 12 минут.

После стерилизации все три раствора смешивают, устанавливают рН 10-10,2, добавляют воды до 100 мл, 1,6%-ного спиртового раство­ра бромтимолового синего, 200 ЕД/мл полимиксина М. Среду раз­ливают по 5 мл в пробирки.

Среда Эндо (фуксин-сульфитный агар с полимиксином и кристаллвиолетом для энтерококков). К расплавленной среде Эндо добавляют 200 ЕД/мл полимиксина М и 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета на 100 мл среды. Колонии энтерококков ярко-крас­ного цвета.

Желчно-цитратная среда (для энтерококков). К 100 мл МПА до­бавляют 20 мл дрожжевого автолизата, 100 мл желчи, 40 г цитрата натрия. Смесь кипятят на водяной бане, добавляют 0,1 г трифенилтетразолия хлористого и 200 ЕД/мл полимиксина М. Колонии энтеро­кокков розово-красного цвета.

Бактерии рода Listeria

Общая характеристика возбудителя

Листериоз – зооантропонозная болезнь животных и человека, характеризующаяся поражением нервной системы, септическими явлениями, абортами и маститами.

В отличие от таких заболеваний как сальмонеллезы, иерсиниозы и некоторые другие инфекционные болезни, листериоз назван не в честь своего первооткрывателя. Возможно, что это связано с тем, что пальма первенства была в руках нескольких исследователей. Пристальное изучение листериоза и его возбудителя началось после публикации в 1926 году E. Murray, R. Webb, M. Swann работы о вспышке новой инфекционной болезни морских свинок и кроликов в питомнике Кембриджского университета и сообщении J. Pirie в 1927 году (Ю. Африка) об инфекционной болезни степных грызунов – «Tiger river disease» (болезни реки Тигр). Однако, еще в 1891 году M. Hayem во Франции и в 1893 L. Henlie в Германии наблюдали грамположительные палочки в срезах тканей пациентов, погибших от болезни, которая ретроспективно была определена как листериозная инфекция. В 1892 году Lucent описал септическую болезнь кроликов, выделив бактериальную культуру, идентичную листериозной палочке. В 1911 году шведский ученый G. Hulphers выделил из гнойного узелка печени павшего кролика маленькую грамположительную палочку, похожую по описанию на листериозную. В 1917 году австралийский врач E. Atkinson сообщил о небольшой эпидемии менингита, вызванной грамположительной бациллой дифтероидного типа. Однако зачастую это все была описательная информация. Первая хорошо сохранившаяся лабораторная культура листерий выделена J. Dumont, L. Cotoni в 1918 году из спинномозговой жидкости солдата, больного менингитом. Она через 20 лет хранения в Пастеровском институте была идентифицирована J. Paterson. Каждый из исследователей самостоятельно давал обнаруженной бактерии родовое и видовое название. И только после работ E. Murray, R. Webb, M. Swann, J. Pirie, когда была установленна идентичность выделенной ими бактериальной культуры, было дано официально признанное название рода Listerella и вида monocytogenes. В 1940 году родовое название изменили на Listeria.

Установлено, что листериоз поражает людей, многие вид домашних и диких животных, а также птиц. Есть сообщения о выделении листерий у рыб, раков, лягушек, некоторых видов клещей, блох, вшей, личинок оводов (Бакулов, 1967).

Дифференциация листерий от микроорганизмов других родов

В таблице 11 перечислены свойства, используемые при дифференцировании бактерий рода Listeria от других грамположительных, не образующих спор, имеющих форму палочек бактерий.

Идентификация новых изолятов может быть осуществлена путем исследования морфологии клеток, морфологии колоний и гемолитических реакций на агаре (содержащем 5% (объем/объем) крови овец или лошадей), сине-зеленого цвета колоний, когда их рассматривают под микроскопом на триптозном агаре методом косого (бокового) освещения после 18-24 ч роста при 37°С, требований к кислороду, образования каталазы, гидролиза эскулина и гиппурата натрия, образования щелочной фосфатазы и образования кислоты из углеводов в соответствующей среде. Серологическая идентификация может быть использована для определенной идентификации листерий.

Таблица 11. Свойства, по которым различают род Listeria

Таксон	Подвижность	Кислородные требования	Рост при З6°С	Каталаза	Продуцирование H2 S	Кислота из глюкозы
Brochothrix	—	факультативные	—	+	—	+
Erysipelothrix	—	факультативные	+	—	+	+
Listeria	+	факультативные	+	+	—	+
Lactobacillus	—	факультативные	+	—	—	+
Kurthia	+	аэробные	+	+	—	—

Представителей рода Listeria чаще всего можно спутать с бактериями родов: Brochothrix, Lactobacillus, Erysipelotrix, Kurthia. Коккобацилярные формы рода Listeria можно смешать с кокковыми микроорганизмами. В этом случае дифференциальным тестом является реакция на каталазу. Листерии можно легко отличить от бактерий рода Kurthia по их различным кислородным требованиям, Kurthia - это строго аэробный род; по ферментации различных сахаров виды Kurthia в реакциях ферментации, либо образуют небольшое количество кислоты, либо вообще ее не образуют.

Виды Listeria можно отличить от бактерий рода Erysipelotrix по положительной реакции на каталазу, по образованию колоний с заметным сине-зеленым блеском на триптозном агаре (Дифко) при исследовании под микроскопом методом косого освещения; по подвижности; по более сильной сахаролитической активности; по гидролизу эскулина и гиппурату натрия. Бактерии этих родов отличаются по антигенному составу.

Виды листерий можно отличить от большинства лактобацилл по положительной реакции на каталазу. Существуют, однако, каталазоположительные лактобациллы и некоторые штаммы листерий, являющиеся каталазоотрицательными. Бактерии рода Listeria очень медленно растут или вообще не растут на среде MRS (de Mann. et. al. 1960), на этой среде лактобациллы растут очень хорошо. Исследования показали, что при комнатной температуре штаммы Listeria подвижные, тогда как большинство лактобацилл не двигается. При микроскопическом исследовании методом косого освещения на триптозном агаре лактобациллы не показывают сине-зеленого оттенка. Различие между двумя родами заключается также в ферментации углеводов.

Серологически бактерии родов Listeria и Lactobacillus отличаются друг от друга.

В некоторых отношениях представителей рода Listeria можно легко спутать с Brochothrix. Оба эти рода часто выделяют из расфасованного мяса и птицы, которые хранят при температурах рефрижераторов. Отличить два рода можно по неспособности Brochothrix thermosphacta к росту при 37°С и по неспособности рода Listeria к росту на среде Cartner (1966). Колонии Brochothrix thermosphacta, выращенные на триптозном агаре, исследованные под микроскопом методом косого освещения, не выглядят сине-зелеными. Кроме того, Brochothrix thermosphacta не гидролизует гиппурат натрия, но образует кислоту из большого количества сахаров. Серологически два таксона отличаются друг от друга (Wilkinson, Vones 1975).

Внутривидовая дифференциация листерий.

Учитывая, что только два вида, Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii, являются патогенными и представляют опасность для макроорганизма, мы считаем целесообразным привести характеристику каждого вида листерий для их идентификации. Как уже выше упоминалось, в нашей стране нет серологических диагностикумов для видовой типизации, и поэтому внутриродовую дифференциацию листерий приходится проводить по иным признакам.

Listeria
monocytogenes

Этот вид является типовым для бактерий данного рода. Для микроорганизмов этого вида характерными являются следующая группа признаков. Это неспорообразующие, короткие палочки правильной формы диаметром 0,4-0,5 мкм и длиной 0,5-2 мкм, с закругленным концами. Иногда встречаются клетки с слегка изогнутыми концами. Расположение в мазках либо поодиночке, либо в коротких цепочках, возможно в виде частокола или же римской буквы V.

В мазках можно увидеть и групповое расположение, параллельное вдоль длинной оси. В мазках из инфицированного пат. материала или из жидкой среды встречаются листерии кокковой формы диаметром 0,4-0,5 мкм и длиной 0,4-0,6 мкм. Они могут быть ошибочно приняты за стрептококки. В более зрелых или необработанных культурах могут встречаться формы в виде волокон длиной до 6-20 мкм.

Окраска по Граму положительная. Но в старых культурах теряют способность к сохранению окраски по Граму. Некислотоустойчивы.

C. Smith, J. Metzger (1962) сообщили о наличии мукополисахаридной капсулы у листерий, однако другие исследователи не подтвердили этого факта. В частности, Н. Seeliger (1968) в результате детальных исследований опроверг факт наличие капсулы у данного микроорганизма.

Листериозная палочка во время культивирования при комнатной температуре всегда подвижна. При температуре +37°С жгутики как правило, не образуются и листерии оказываются неподвижными.

Листериозная культура данного вида является аэробной и факультативно анаэробной. Температурный диапазон роста от +1 до +4°С. Однако культура остается жизнеспособной и при более высоких температурах (до 70-71°С). Температурный оптимум 25-37°С. Листерии способны расти и размножаться в диапазон рН от 6 до 9, но сохраняют свою жизнеспособность при величине рН 5-11. Оптимальные условия роста при рН 7,0-7,4. В анаэробных условиях, на кровяном агаре при температуре 35-37°С и рН 7,2-7,4 суточный рост листерий проявляется в виде росинчатых колоний. В аэробных условиях, на питательном агаре, оптимальном температурном диапазоне, 24-48-часовые листериозные колонии имеют диаметр 0,5-1,5 мм, круглые, полупрозрачные в виде капли, выпуклые с ясно очерченной поверхностью и сплошной гранью. При обычном освещении колонии обладают серо-голубоватым цветом. Размер 3-7-дневных колоний достигает диаметра 3-5,5 мм, колонии с непрозрачным центром и неправильной формы. В полужидкой среде 0,25%-ного агара суточный рост идет вдоль укола. В МПБ рост идет медленно, но через 28-48 часов появляется нежное, опалесцирующее помутнение. Через 7 дней на дне пробирки образуется осадок, который при встряхивании образует поднимающуюся вверх косичку. Бактерии обладают гемолитической активностью. Слабая, едва уловимая гемолитическая активность может быть усилена использованием САМР-теста. Листериозная культура в большинстве случаев является каталазоположительной и оксидазоотрицательной, но необходимо учитывать, что если питательные среды содержат низкие концентрации мясного и дрожжевого экстракта, то возможна отрицательная каталазная реакция. Активность каталазы подавляется на средах, содержащих высокую (более 10%) концентрацию глюкозы.

Реакция с метил-ротом и Фогес-Проскауэра положительна.

Листерии не разжижают желатин, не гидролизуют казеин и молоко. Индол не продуцируют, на обычных питательных средах не образуют сероводород. Расщепление сахаров сопровождается образованием кислоты, но не газа.

Листерии могут расти в сложных средах, содержащих до 10% NaCl. В течение года остаются жизнеспособны при 16% содержании поваренной соли (рН-6,0), некоторые штаммы выживают даже 20% содержании NaCl.

Необходимо отметить, что хотя вышеперечисленные свойства листерий достаточно типичны, но возможны их изменения, связанные с определенными питательными средами или выделением новых штаммов.

Штаммы данного вида различаются по антигенному составу и включают следующие серовары: 1/2а, 1/2в, 1/2с, 3а, 3в, 3с, 4а, 4ав, 4с, 4d, 4е и серовар 7. Бактерии вида экспериментально патогенны для мышей и морских свинок. Проба Антона положительная. Этот вид широко распространен в природе. Его выделяют из сточных вод, почвы, силоса и из фекалий животных и здоровых людей. У человека и животных его выделяют при клинических признаках болезни. Вызывает менингоэнцефалит, септицемию, эндокардит, аборты, абсцессы и гнойные ранения местного характера.

Listeria innocua

(innocus – безопасный).

Морфология бактерий аналогична бактериям вида Listeria monocytogenes. Не гемолитичен на 5 или 10%-ной (объем/объем) крови овец, кроликов, лошадей или человека в жидких или твердых культуральных средах. САМР – отрицательный со S. aureus, R. equi. Большинство изученных штаммов образует кислоту из рамнозы. Все образуют кислоту из метил-D-маннизида. Кислоту не образуют из ксилодазы и D-маннитола. Все исследованные до сих пор штаммы имеют антигенный состав серогруппы 6 (серовары 6а и 6в) и серовара 4ав.

Этот штамм в опытах был непатогенен для мышей и морских свинок, если его вводят внутрибрюшинно в концентрации до 1010
клеток. Проба Антона отрицательная. Выделяют из почвы растений, фекалий человека и животных и из птичьего помета. Никогда не выделяют из явно патологического материала от человека и животных.

Listeria
welshimeri

Назван в часть американского бактериолога H.J. Welshimer.

Морфология аналогична бактериям выше описанных видов.

На кровяном агаре гемолиза не обнаруживают, САMР-реакции со S. aureus, R. equi. – отрицательные. Кислоту образует из D-ксилозы и метил-D-маннозида, а также из L-рамнозы, но из L-рамнозы может и не образовывать. Типовой штамм из L-рамнозы кислоту не образует. Кислоту не образует из D-маннитола. Штаммы, которые в настоящее время относят к этому виду, принадлежат к серовару 6а или 6в. Антигенный состав типового штамма, такой же, как у серовара 6в. Серовары 6а и 6в встречаются так же у вида Listeria innocua, а некоторые штаммы Listeria seeligeri имеют антигенный состав серовара 6в.

Этот вид экспериментально не патогенен для мышей. Его выделяют из гниющей растительности и из почвы в США; вероятно, он широко распространен в природе.

Listeria
seeligeri

Назван в честь H. Seeliger, немецкого бактериолога.

Морфология бактерий такая же, как и у вида Listeria monocytogenes. Гемолиз слабый. САМР-реакция положительная при использовании штаммов S.aureus, со штаммами R. equi – отрицательная. Бактерии кислоту образуют из D-ксилозы. Кислоту не образуют из D-маннитола и L-рамнозы. Большинство штаммов не образуют кислоту из метил-D-маннизида; типовой штамм в этом отношении отрицательный.

Штаммы, приписываемые в настоящее время к этому виду, имеют антигенный состав сероваров 1/2в, 4с, 4d (которые встречаются также у Listeria monocytogenes) и 6в (который обнаруживают в некоторых штаммах Listeria innocua, Listeria welshimeri). Типовой штамм принадлежит к серовару 1/2в.

В опытах был непатогенен для мышей. Его выделяют из растений, почвы и фекалий животных в Европе; вероятно, широко распространен в природе.

Listeria
ivanovii

Назван в честь Ивана Иванова – болгарского микробиолога.

Морфологическая особенность – отсутствие жгутиков. Штаммы вида неподвижны.

Наблюдается ярко выраженный гемолиз с двойными или тройными зонами, если листерию этого вида выращивают на агаре с кровью овец или лошадей (5% объем/объем). Положительная САМР-реакция наблюдается при использовании R equi, а не S. aureus. Из D-маннитола, L-рамнозы или метил-D-маннизида кислоту не образует. Все исследованные штаммы принадлежат к серовару 5. Этот антигенный состав в штаммах других видов рода Listeria не обнаруживали.

Listeria ivanovii экспериментально патогенен для мышей, LD50
для которых у бактерий этого вида колеблется между 1·105
и 3·106
колониеобразующих единиц на 1 мл. Патогенен для животных, особенно для суягных овец, листерию этого вида выделяли также из организма здорового животного, человека-носителя и из окружающей среды и очень редко из организма человека в клинических условиях.

Listeria
grayi

Назван в честь М. Gray, американского бактериолога, известного своими работами по листериозу.

Прямые палочки размером 0,6-0,8 мкм ´ 0,7-2,5 мкм. Концы закругленные. Встречаются парами или в коротких цепочках; палочки иногда расположены под углом друг к другу или лежат параллельными группами вдоль длинной оси. Активный рост наблюдается при 20-25°С; неподвижны или двигаются очень медленно при 37°С, капсул и спор не образуют. Грамположительны. Не кислотоустойчив. Факультативный анаэроб. Хорошо растет на триптозном агаре (Дифко) или на кровяном агаре (Дифко) с добавлением 1% глюкозы (вес объем). Колонии небольшие (1-1,5 мм через 24 ч), круглые, гладкие, маслянистые, слегка выпуклые с неизрезанным краем.

При изучении на этих средах небольших колоний (0,2 мм) с помощью непрямых лучей света обнаруживают тот же самый сине-зеленый оттенок, что у бактерий вида Listeria monocytogenes; после более длительной инкубации колонии становятся оранжево-красными, особенно по краям. Гемолиз не вызывают. Температура оптимального роста 30-37°С. Температурные границы роста 1-45°С. Не выживают при 60° нагревании в течение 30 минут. Каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Требуются органические факторы роста. Растут при рН 5-9, при рН 9,6 рост не наблюдается. Чувствителен к пенициллину, стрептомицину, хлорамфениколу, эритромицину, новобиоцину, неомицину; резистентны к сульфаниламиду, полимиксину, к сульфату колостина и к налидиксовой кислоте. Не растет на среде Lardner (1966). Медленный рост может происходить на среде MPS (Маnn et. аl., 1960).

Ферментативный метаболизм глюкозы приводит к образованию молочной кислоты и некоторых других продуктов. Из эскулина, амигдалина, целлобиозы, декстрина, галактозы, глюкозы, глицерина, лактозы, фруктозы, мальтозы, маннита, маннозы, салицина, крахмала, трегалозы образуется кислота, а не газ. Кислота обычно не образуется из мелибиозы, рамнозы, сорбита, метил-D-глюкозида, адонита, арабинозы, дульцита, эритрита, гликогена, инозита, инулина, мелецилозы, раффинозы, сорбита, сахарозы и ксилозы. В лакмусовом молоке обнаруживается слабая кислота и незначительная редукция. Реакция с метиловым красным и Фогес-Проскауэра положительная.

Эскулин гидролизуют. Гиппурат натрия не гидролизуют. Гидролиз крахмала непостоянен. Твин-20 гидролизуют медленно (14 дней). Твин-80 не гидролизуют. Медленное образование дезоксирибонуклеазы, рибонуклеазы и фосфатазы. Ксантин, тирозин не расщепляют. Целлюлоза, желатин, казеин и молоко не гидролизуют. Индол не образуют. Мочевину не гидролизуют. Небольшие количества H2
S (обнаруженные с помощью реакции со свинцовой бумагой) образуются некоторыми штаммами. Нитраты в нитриты не восстанавливаются.

Серологически бактерии отличается от остальных видов рода Listeria. Антигенный состав идентичен Listeria murrау. Не патогенны для мышей при внутрибрюшинной или внутримозговой инъекции, но клетки в концентрации 5·108
могут быть токсичны для мышей. Не патогенны для беременных кроликов после внутривенного введения. Не вызывают у кроликов или морских свинок конъюнктивит после закапывания в глаза. Выделяются из фекалий шиншиллы. Естественная среда неизвестна.

Listeria
murrау

Назван в честь Е. Мurrау – одного из первых исследователей бактерий рода Listeria.

Прямые палочки размером 0,6-0,8 ´ 7-2,5 мкм. Концы закругленные. Встречаются отдельными парами или короткими цепочками, палочки часто располагаются под углом друг к другу или параллельно вдоль длинной оси. Подвижны при культивировании 20-25°С, неподвижны или слабо подвижны при 37°. Капсулы и споры не образуют. Грамположительны. Неустойчивы к кислотам. Факультативные анаэробы. Хорошо растут на триптозном агаре (Дифко) или на кровяном агаре (Дифко) с добавлением 1%-ной (вес/объем) глюкозы. Колонии небольшие (1-1,5-мм через 24 ч.), круглые, гладкие, маслянистые, немного выпуклые с неизрезанными краями. В отраженном свете колонии имеют серый цвет с голубоватым оттенком; при дневном свете их голубой цвет более яркий, а с увеличением размера после дальнейшей инкубации у них начинает появляться желтый оттенок. Когда с помощью рассеивающего света при микроскопировании изучали колонии на поверхности сред, обнаруживали, что небольшие колонии (0,2 мм) имеют тот же самый зелено-синий оттенок, вызванный, как и у вида Listeria monocytogenes; после 2-дневной инкубации у более крупных колоний обнаруживается оранжево-красный оттенок (Н. Welshimeri. et. al., 1971). При 22-25° инкубации на питательном агаре, содержащем глюкозу, у колоний появляется желтый пигмент. В отсутствии глюкозы пигмента не обнаруживают. Негемолитичны на кровяном агаре. Оптимальная температура роста 30-37°С. Температурные границы роста 1-45°С. Не выдерживают 30-минутного нагревания при 60°С. Каталазоположительны. Оксидазоотрицательны. Чувствительны к пенициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, эритромицину, новобиоцину, неомицину; резистентны к сульфаниламиду, полимиксину В, к сульфату колистина и налидиксовой кислоте. Не растут на среде Lardner (1966).

Ферментативный метаболизм глюкозы приводит к образованию L+
-молочной кислоты и некоторых других продуктов. Из эксулина, амигдалина, целлобиозы, декстрина, галактозы, глюкозы, глицерина, лактозы, фруктозы, мальтозы, маннита, маннозы, силицина, крахмала и трегалозы образуется кислота, а не газ. Некоторые штаммы образуют кислоту из мелибиозы, рамнозы и сорбита. Из метил-D-глюкозида образуется небольшое количество кислоты. Из адонита, арабинозы, дульцита, эритрита, гликогена, инозита, инулина, мелицитозы, раффинозы, сахарозы и ксилозы кислота обычно не образуется. Лакмусовое молоко показывает слабокислую реакцию и незначительную редукцию. Реакции с метиловым красным и Фогес – Проскауэра положительные.

Эксулин гидролизуют. Гиппурат натрия не гидролизуют. Гидролиз крахмала непостоянен.

Твин-20 гидролизуют медленно (14 дней). Твин-80 не гидролизуют. Медленно образуют дезоксирибонуклеазу, рибонуклеазу и фосфотазу. Ксантин, тирозин и хитин не расщепляют. Целлюлозу, желатин, казеин и молоко не гидролизуют. Индол не образуют. Мочевину не образуют. Некоторые штаммы образуют H2
S (обнаруживается с помощью реакции со свинцовой бумагой). Серлогически отличаются от вида Listeria monocytogenes. Антигенный состав идентичен антигенному составу Listeria grayi.

После закапывания в глаза кроликов конъюнктивит не вызывают.

Не патогенны ни при внутривенном введении кроликам, ни при внутрибрюшинной инъекции 108
клеток 20-граммовым мышам.

Выделяли из гниющих листьев злаковых (маис); естественной средой обитания, вероятно, являются почва и растения.

Лабораторная диагностика

Материалы для исследования – кровь, СМЖ, слизь из зева, пунктаты увеличенных лимфатических узлов, у новорожденных дополнительно – меконий, пупочная кровь; секционный материал — кусочки мозга, печени, селезенки, лимфатические узлы. Посевы рекомендуется делать в первые 7-10 сутки болезни; кровь (10мл) и СМЖ (2-5 мл) засева­ют на 100-150 мл глюкозного, глюкозо-печеночного или глюкозо-глицеринового бульона; инкубируют при температуре 37°С до 3 недель. При посеве на глюкозо-кровяной агар отби­рают типичные колонии (прозрачные или роговидные), дающие гемолиз. Также можно проводить посев на триптозный агар и просматривать чашки под микроскопом при косом освещении — суточные колонии листерий имеют сине-зеленую окраску.

Общие положения

Листериоз – инфекционное заболевание из группы зооантропонозов, характеризующееся полиморфностью клинического проявления, в последнее время как пищевая инфекция людей с тенденцией к генерализации, септикопиемии, а так же поражению различных органов и систем жизнедеятельности у людей и животных.

Листериоз относится к числу широко распространенных в мире инфекций, что обусловлено выраженной адаптационной способностью возбудителя. Исследования трех последних десятилетий позволили сформулировать заключение о повсеместном распространении данной инфекции в России.

Материалы для исследования
В бактериологическую лабораторию направляют не менее 200 грамм исследуемого субстрата, упакованного в водонепроницаемую тару и желательно в первые 1-3 часа после отбора. Если время доставки образцов свыше указанного срока, то материал допускается направлять в замороженном виде в термосе со льдом.
Порядок исследования материала
Бактериологическое исследование проводят в соответствии с прилагаемой ниже схемой, а идентификацию выросших колоний - по тестам, указанным в таблице 12. Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб.
Оценка результатов бактериологического исследования.

При соответствии полученных результатов по тестированию выделенной культуры с вышеуказанными данными полученный бактериальный штамм признают как бактериальную культуру вида Listeria monocytogenes.

В случае если изучаемая бактериальная культура не типируется как бактерии вида Listeria monocytogenes, возможен вариант повторного использования бактериальной суспензии со средой накопления, хранящейся в холодильнике при +4°С.

Общие сроки бактериологического исследования материала в пределах 7 суток.

Рисунок 9. Принципиальная схема выделения Listeria monocytogenes

Серологические исследования. Обычно ставят РА с листериозным диагностикумом.

Фаготипизация.
Используют листериозные фаги L 2А и L4А (ВНИИВВиМ).

Таблица 12. Характеристика биологических свойств листерий, штаммов первой серогруппы (шт. 766) и второй серогруппы (шт. 634)

	Шт. 766	Шт. 634
Окраска по Граму	+	+
Подвижность: 37°С	–	–
22°С	+	+
В-гемолиз	+	+
Каталаза	+	+
ферментация:
Лактозы	+	+
Сахарозы	+	+
Глюкозы	+	+
Мальтозы	+	+
Маннита	–	–
Рамнозы	+	+
Дульцита	–	–
Арабинозы	–	–
Инозита	–	–
Сорбита	–	–
Салицина	+	+
Галактозы	–	–
Ксилозы	–	–
Раффинозы	–	–
Эскулина	+	+
Фруктозы	+	+
Конъюнктивальная проба (проба Антона)	+	+

Биологическая проба. Лучше всего использовать белых мышей, иммуносупрессированных кортизоном (4-5 мг в/м за 4ч до заражения); после гибели животного (обычно на 2-6 сут.) производят посев материала из различных органов. Следует помнить, что листерии характерино «холодовое обогащение», и для избежания ошибок в диагностике часть патологического материала следует поместить в стерильные пробирки и хранить в течение 5-10 сут. при температуре 4-6°С, а затем подвергнуть повторному исследо­ванию. Ставят конъюнктивальный тест на морских свинках (проба Антона).

Рецепты и способы приготовления питательных сред для выделения листерий

1. Среда с теллуритом калия

(Бакулов и др., 1970).

К 1 л расплавленного МПА (рН 7,2-7,4) перед разливом в бактериологические чашки добавляют 10 мл 2%-го водно-глицеринового раствора теллурита калия. Добавление к указанной среде 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота улучшает рост листерий.

2. Среда с теллуритом калия и флоромицином или полимиксином

(Бакулов и др. 1970).

К 1 л расплавленного МПА (рН 7,2-7,4) перед разливом добавляют 10 мл 2%-го водно-глицеринового раствора теллурита калия и 0,3-0,5 мл раствора флоримицина или полимиксина (500 тыс. ед. препарата разводят в 10 мл физиологического раствора).

Цвет колонии на среде с теллуритом калия черный.

Предоставленная далее рецептура NN 3-11 предложена Подкомитетом по таксономии листерий и является унифицированной для всех лабораторий, работающих с данным микроорганизмом.

3. Триптозно-фосфатный бульон (ТРВ).

Триптоза	20,0 мг
Декстроза	2,0 г
Хлорид натрия	5,0 г
Динатрий фосфат	2,5 г
Дистиллированная вода	1000,0 мл

Добавьте ингредиенты к воде. Хорошо смешайте. Когда растворится, доведите рН до 7,3. Разлейте и стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 15 минут.

4. Триптозно-фосфатный бульон с полимиксином В

(Бойсен-Мюллер).

Триптоза	20,0 мг
Декстроза	2,0 г
Хлорид натрия	5,0 г
Динатрий фосфат	2,5 г
Дистиллированная вода	1000,0 мл

Добавьте ингредиенты к воде. Размешайте. Когда растворится, доведите рН до 7,3. Стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 15 минут. Охладите и добавьте 5,0 г стерильной тиамин-HCl и 3,12 мг полимиксина В к 1 л ТРВ. Перемешайте.

5. Триптозный агар.

Все ингредиенты среды «ТРВ». После растворения добавить бакто-агар «Дифко» – 15,0 г. Стерилизовать автоклавированием при +121°С в течение 15 минут. После охлаждения добавить 5,0 г стерильного тиамин-НСl и перемешать.

6. Сывороточный агар.

После контролирования рН добавьте агар к бульону. Стерилизуйте автоклавированием при +121°С в течение 15 минут. Охладите до +48°..+50°С и добавьте бычью сыворотку. Осторожно перемешайте.

7. Кровяной агар.

Триптоза	10,0 г
Порошок «Лаб-Лемко» (Оксоид)	3,0 г
Хлорид натрия	5,0 г
Бакто-агар (Дифко)	15,0 г
Дистиллированная вода	1000,0 мл

Суспендируйте ингредиенты в воде, кроме агара. Хорошо смешайте. Доведите рН до 7,3-7,4. Добавьте агар и стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 15 минут. Охладите среду до +48°- +50°С и добавьте 50,0 мл стерильной дефибринированной овечьей (лошадиной) крови. Осторожно смешайте и разлейте в чашки Петри.

8. Бульон Левинталя с трипафлавином и налидиксиновой кислотой

(по Раловичу).

Порошок «Лаб-Лемко»	10,0 г
Пептон	10,0 г
Хлорид натрия	5,0 г
Дистиллированная вода	1000,0 мл
Дефибринированная овечья кровь	50,0 мл

Поместите все ингредиенты в колбу и «проварите» на пару при 100°C в течение 1 часа. Отфильтруйте и доведите рН до 7,4. Стерилизуйте автоклавированием при +121°C в течение 15 минут. Добавьте 2,0 мл 1%-го триптофлавина и 20 мл 2%-го раствора налидиксиновой кислоты. Смешайте, разлейте в пробирки и закупорьте резиновыми пробками.

9. Среда с ацетатом таллия и налидиксовой кислотой (TN).

Питательный бульон	1000,0 мл
Глюкоза	2,0 г
Ацетат таллия	2,0 г
Налидиксовая кислота	40,0 мкг/мл

Налидиксовую кислоту 0,5 г в кристаллах растворяют в 0,5 мл 1%-го раствора NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды и соответствующего объема основной среды перед 15-минутным автоклавированием при +121°С.

10. Среда с тиоцианатом и налидиксовой кислотой (PTN).

Питательный бульон	1000,0 мл
Тиоцианат калия	37,5 г
Налидиксовая кислота	40,0 мкг/мл

Питательный бульон, содержащий тиоцианат калия, стерилизуют в течение 15 минут при +121°С. Затем добавляют налидиксовую кислоту.

11. Агар с триптофлавином и налидиксовой кислотой.

Триптозный агар «Дифко»	41,0 г
Налидиксовая кислота	0,04 г
Дистиллированная вода	1000,0 мл

Налидиксовую кислоту 0,8 г растворяют в 10 мл NaOH. Затем, добавляя дистиллированную воду, доводят до 100,0 мл. 5 мл этого раствора, содержащего налидиксовую кислоту, добавляют к основной среде для получения конечной концентрации 40 мкг/мл. После 15-минутной стерилизации при +120°С среду охлаждают до 70°C. Акрифлавин нейтральный растворяют в стерильной дистиллированной воде для получения 0,5% (вес/объем) раствора. Два миллилитра этого раствора добавляют к среде, содержащей триптозно-налидиксовую кислоту, чтобы получить конечную концентрацию в 10 мкг/мл. Среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам.

12. Мак Брайда листериозный агар MLA

(по прописи Lovett, 1988).

Фенилэтаноловый агар «Дифко»	35,5 г/л
Глицинангидрид	19,0 г/л
Хлористый литий	0,5 г/л
Овечья кровь	5 %

13. Модифицированный листериозный агар Мак Брайда

(по прописи Lovett, 1988)

Среда МLА, но вместо овечьей крови добавляют 0,2% циклогексамида.

14. Селективный агар Мак Брайда

(по прописи Schidt et. al., 1988)

Казеин пептон с триптическими добавками	15,0 г/л
Пептон соевой муки	5,0 г/л
Хлористый натрий	5,0 г/л
Фенилэтиловый спирт	2,5 г/л
Глицин	10,0 г/л
Хлористый литий	0,5 г/п
Агар	15,0 г/л
Дистиллированная вода	1000,0 мл
рН – 7,3

15. Обогащенная среда для выделения листерий

(по прописи Lee, McClain, 1986).

В питательную среду добавляют:

Протеаза пептона	5 г/л
Триптон	5 г/л
Порошок «Лаб-Лемко»	5 г/л
Экстракт дрожжей	5 г/л
Na2 HPO4	12 г/л
NaCl	20 г/л
КН2 РО4	2,35 г/л
Эскулин	1 г/л
Налидиксовая кислота	20 мкг/л
Акрифлавин	20 мкг/л

16. Агаровая среда для выделения листерий

(по прописи Rodriquez et. al.).

Пептон	3,0 г/л
Неопептон	3,0 г/л
Протеаза пептона	3,0 г/л
Хлористый натрий	5,0 г/л
Эскулин	1,0 г/л
Na2 HPO4 · 2Н2 О	12,0 г/л
Аммоний-железо сульфат	1,0 г/л
Акрифлавин	0,012 г/л
Налидиксовая кислота	0,050 г/л
Агар	15,0 г/л

17. Среда для выделения листерий (LPM)

Фенилэтаноловый агар «Дифко»	35,5 г/л
Глицин ангидрид	10,0 г/л
Хлористый литий	5,0 г/л
Моксалат	20 мкг/л

18. Селективная среда FDA

(по прописи Schidt et. al., 1988).

Триптический перевар (BBL)	30,0 г/л
Экстракт дрожжей	6,0 г/л
Акрифлавин-HCl	16,0 мг/л
Налидиксовая кислота	40,0 мг/л
Циклогексамид	50,0 мг/л

19. Листериозная селективная среда FDA/IDF-FIL

(по прописи Merck).

Казеиновый пептон	17,0 г/л
Пептон Sojmeal	3,0 г/л
D+ глюкоза	2,5 г/л
Хлористый натрий	5,0 г/л
КН2 РО4	2,5 г/л
Дрожжевой экстракт	6,0 г/л
РН – 7,3

20. Среда LEB

Триптикасоевый бульон	1000,0 мл
Экстракт дрожжей	6,0 г/л
К2 НРО4	2,5 г/л

Автоклавировать 15 минут при 121°C. Перед применением добавить (после стерилизации фильтрацией) в объеме 0,5% раствор

Акрифлавина-HCl	3,0 мл/л
Налидиксовой кислоты	8,0 мл/л
Раствор 1% циклогексамида в этаноле 40%	5,0 мл/л

21. Селективно-обогащенная среда для листерий

(по прописи Rodriquez et. al., 1985).

Пептон	5,0 г/л
Неопептон	5,0 г/л
Порошок «Лаб-Лемко»	10,0 г/л
Рамноза	2,0 г/л
Хлористый натрий	50,0 г/л
Na2 HPO4 · 2H2 O	53,22 г/л
КН2 РО4	1,35 г/л
Налидиксовая кислота	0,05 г/л
Трипановый голубой	0,08 г/л

22. Селективная среда PAL CAM

(по прописи Merck).

Пептон	23,0 г/л
Крахмал	1,0 г/л
Хлористый натрий	5,0 г/л
Агар-агар	13,0 г/л
Эскулин	0,8 г/л
Аммоний железо (III) сульфат	0,5 г/л
D-маннит	10,0 г/л
Феноловый красный	0,08 г/л
Глюкоза	0,5 г/л
Хлористый литий	15,0 г/л
рН – 7,0

23. Селективная среда для выделения листерий (PAL CAM)

(по прописи Netten et. al., 1989).

Представляет собой Columbia-агар (кровяной агар) с содержанием:

Глюкозы	0,05%
Полимиксина В	0,001%
Акрифлавина	0,0005%
Хлорида лития	1,5%
Цефтазидима	0,002%
Эскулина	0,08%
Аммоний железо (III) сульфат	0,05%
Маннита	1,0%
Фенолового красного	0,008%

(колонии серо-зеленые с черным, с впалым центром и черным ободком на вишнево-красном фоне среды).

24. Селективная среда для листерий

(по прописи Lachica, 1990).

Седечно-мозговой агар «Дифко», содержащий:

Хлористого лития	0,5%
Глицина	1,0%
Цефтазима	50,0 мкг/мл

(колонии с синеватым оттенком)

25. Селективная среда для листерий

(по прописи Leighton, 1979).

Триптознофосфатный бульон с

Ацетатом таллия	200,0 мкг/л
Налидиксовой кислоты	50,0 мкг/л

26. Селективная среда CNPA

(по прописи Jay, 1987).

Триптон	20,0 г
Хлористый натрий	10,0 г
Д-глюкоза	5,0 г
Дрожжевой экстракт	2,0 г
ТРИС	7,0 г
Агар	15,0 г
1,2-циклогексанедион	3,0 г
Налидиксовая кислота	45,0 мкг
Фенилэтиловый спирт	1,0 мл
Дистиллированная вода	1000,0 мл

рН – 8,2

27. Селективная среда

(по прописи Lucas et. al., 1990).

Агар с переваром бычьего сердца и мозга «Дифко»	52,0 г/л
Хлорид лития	15,0 г/л
Эскулин	0,75 г/л
Акрифлавин гидрохлорид	0,005 г/л
Дистиллированная вода	1000,0 мл

Смесь автоклавируют при +121°C 15 минут, охлаждают до 45°C и добавляют:

Стерильный цитрат железа аммония	70 мл 0,7%
Теллурит калия	10 мл 2,0%
Полимиксин В	10 мл 0,1%
Натриевая соль нефтазидимапентагидрата	10 мл 0,2%

На разлитую в чашки Петри среду проводят посевы, инкубируют при +37°C, затем чашки с колониями охлаждают до +4°C и добавляют 8 мл расплавленного и охлажденного до +45°C агара верхнего слоя, в состав которого входят:

Сухой бульон из перевара бычьего сердца и мозга «Дифко»	37,0 г/л
Агар	3,0 г/л
Хлористый натрий	8,0 г/л
Суспензия эритроцитов барана	50,0 мл/л

Через 14 часов инкубации при 30°C появляется зона гемолиза.

28. Листериозная селективная среда FEINDT

(по прописи Merck).

Триптоза	20,0 г/л
D-глюкоза	1,0 г/л
Хлористый натрий	5,0 г/л
Витамин В1	0,005 г/л
Трипафлавин	0,01 г/л
Налидиксовая кислота	0,04 г/л
Агар-агар	13,0 г/л

рН - 7,4

29. Селективная среда для выделения листерий Oxford

(по прописи Merck)

Пептон	23,0 г/л
Крахмал	1,0 г/л
Хлористый натрий	5,0 г/л
Агар-агар	13,0 г/л
Эскулин	1,0 г/л
Аммонии железо (III) сульфат	0,5 г/л
Хлористый литий	15,0 г/л

рН – 7,0

Каждая из указанных питательных сред не лишена недостатков. Часть этих методов, способов и питательных сред дает отличные результаты в некоторых лабораториях, но не во всех. Это можно объяснить различным качеством применяемых химикатов.

Бактерии рода Erysip
elothrix

Род Erysipelothrix — прямые или слегка изогнутые палочковидные бактерии (0,8-2,5´0,2-0,4 мкм), имеющие тенденцию образовывать длинные нити длиной до 60 и более мкм; послед­ние могут утолщаться и содержать гранулы. Неподвижны, спор и капсул не образу­ют; хемоорганотрофы; грамположительны, но в старых культурах могут изменять отношение к окраске по Граму. Факультативные анаэробы; каталазоотрицатель­ны; ферментативная активность слабая — ферментируют глюкозу и некоторые угле­воды с образованием кислоты; на кровяных средах дают a-гемолиз. Широко распростране­ны в природе, паразиты рыб и теплокровных.

Типовой вид — Erysipelothrix rhusiopathiae; Такахаши с соавт. (Takahashi et. аl., 1987) описали второй вид — Е. tonsillarum, отличающийся от первого лишь степенью гомологии ДНК. Все штаммы данного вида принадлежат к одному серовару и маловирулентны для свиней.

Erysipelothrix rhusiopathiae открыли Пастер и Тюилье (1882), Леффлер (1886) как возбудитель рожи свиней и Розенбах (1884) как возбудитель ползучей эритемы Бейкера или эризипелоида. Идентичность обоих микроорганизмов установил Вилявин (1955).

Распространение

Erysipelothrix rhusiopathiae устойчив во внешней среде и распростра­нен повсеместно; на разлагающихся органических субстратах может сохраняться месяца­ми, а в трупах — до года. При высушивании погибает в течение 3 недель, на прямом солнеч­ном свету — за 12 суток; кипячение убивает его в течение 3-5 минут. Неустойчив к действию дезинфектантов. Резервуар — грызуны, насекомоядные и домашние животные, включая птиц (куры, утки, индейки, голуби и др.). Эризипелоид животных — природно-очаговая нетрансмиссивная инфекция; возбудитель может сапрофитировать на различных сортах мяса и рыбы, человек заражается контактным путем, а заболеваемость носит выраженный профессиональный или бытовой характер. В группу риска относят рыбаков, лесорубов, работников боен, ветеринаров и т.д.

Морфология и культуральные свойства

Грамположительная мелкая палочка, часто об­разующая нитевидные формы; в мазках обычно располагается парами, реже одиночно. Хорошо растет на простых слабощелочных средах; оптимальная среда для культивирования — сахар­ный бульон; через 10-15 ч отмечают помутнение, через 40-48 ч образуется белый осадок. Растет в температурных пределах 16-41°С, наиболее быстро при температуре 37°С, но наи­больший выход клеток получают после культивирования при 33°С. Через 24-48 ч рост скуд­ный, в виде мелких, трудно различимых S-колоний; его несколько усиливает добавление глю­козы и сыворотки. Переход в авирулентные R-формы наблюдают при длительном культивировании на искусственных средах. Нитраты не восстанавливает, эскулин не гидролизует; не ферментирует мальтозу, маннит, рамнозу, глицерин, салицин. Выделяют два варианта возбудителя — suis (свиной) и murisepticum (мышиный); первый также патогенен для голубей и не ферментирует сахарозу, второй непатогенен для голубей и ферментирует сахарозу; по прочим свойствам, в том числе по патогенности для белых мышей, оба штамма идентичны. На желатине через несколько суток культивирования образует тонкие нити, перпендикулярные линии укола, что придает культуре вид ершика для мытья посуды.

Антигенная структура.

По антигенной формуле бактерии данного вида разделяются на три группы: F, B, N. Общим видовым антигеном является антиген N. Антиген В обладает протективными свойствами. От больных свиней чаще всего выделяют штаммы сероварианта А.

Патогенез поражений изучен недостаточно; возбудитель проникает через кожу при ее травматизации; реже наблюдают проникновение через слизистую оболочку зева и ЖКТ. Возникновению заболевания способствуют мацерация и длительное охлаждение кожи. Инкубационный период не превышает 1-2 суток. В месте проникновения возбудителя (в фокусе микро- или макротравмы) возникают ограниченные эритематозные темно-красные или розовато-синюшные пятна диаметром от 1 до 5-10 см. Для очагов характерен эксцентрический рост; по мере роста центр поражений бледнеет, а периферия остается ярко окрашенной; эритема быстро растет (в среднем на 1 см/сут), более выраженно продвигаясь в проксимальном направлении. Гистологически выявляют отек дермы, иногда и подкожной клетчатки, акантоз, периваскулярные и перигландулярные мононуклеарные инфильтраты. У больных возникают отеки и болезненность суставов; в процесс могут быть вовлечены регионарные лимфатические узлы. Для заболевания характерно быстрое течение (обычно не более 2 недель), но артралгии и артропатии могут продолжаться дольше и часто рецидивируют. Перенесенное заболевание не вызывает раз­вития стойкого иммунитета, возможны случаи повторного заражения. При нарушениях иммунитета либо при заражении большой дозой возбудитель может лимфо- и гематогенно диссеминировать в различные органы, вызывая метастазирующий сепсис, пневмонии, менингоэнцефалиты, и приводить к гибели больного.

Лабораторная диагностика

Обычно клинический диагноз не вызывает затруднений; при необходимости для дифференциальной диагностики с рожистым воспалением проводят посев содержимого очагов (лучше кусочек измененной кожи). Посев производят на обыч­ные питательные среды (рост в виде мелких колоний наблюдают через 18-24 ч при 37°С) с последующей микроскопией выросших колоний. Существенный признак — способность Erysipelothrix rhusiopathiae образовывать H2
S и вызывать почернение среды Олькеницкого, что нехарактерно для большинства грамположительных палочек. При генерализованных формах проводят бактериологическое исследование крови (дополнительно при секции — печени, селезенки, увеличенных лимфатических узлов) и ставят биологическую пробу с белыми мышами, иммуносупрессированными кортизоном (4-5 мг в/м за 4 ч до подкожного заражения). Мыши погибают через 3-5 суток, и из органов легко выделить возбудитель.

Питательные среды для культивирования Е.
rhusiopathiae

Для выделения культур лучше использовать питательные среды с 5—10% сывороткой крови и 0,2—0,5% глюкозы. При исследовании материала, контаминированного посторонней микрофлорой, целесооб­разно пользоваться селективными средами.

Селективная среда ESB. В 1000 мл стерильного питательного буль­она вносят 50 мл сыворотки крови лошади, 400 мг канамицина, 50 мг неомицина, 25 мг ванкомицина. Среда пригодна для использования в течение 12—14 дней, хранение при 4°С.

Селективная среда МВА. В 1000 мл питательного агара добавляют 0,4 г азида натрия. Стерилизуют при 121°С 15 минут и асептически вносят 50 мл сыворотки крови и 20 мл крови лошади.

Микроорганизмы рода Actinomyces

Длительное время актиномицеты классифицировали как грибы, однако изучение их морфо­логии и биологических свойств позволило отнести их к шизомицетам, т.е. бактериям. В отличие от грибов, актиномицеты не содержат в клеточной стенке хитина или целлюлозы, а сама она аналогична таковой у бактерий; не обладают способностью к фотосинтезу; образуемый ими мицелий достаточно примитивен. Они размножаются только бесполым путем. С бактериями актиномицеты объединяет отсутствие четко выраженного ядра, чувствительность к бактерио­фагам и антибиотикам (при резистентности к противогрибковым средствам), а также способ­ность к хорошему росту в слабощелочной (но не кислой) среде.

Род включает 12 видов, большинство из которых патогенны для животных и человека. Дифференциация видов затруднена из-за вариабельности тест-реакций. Некоторые виды легче типировать методом гель-электрофореза белков, чем по культуральным свойствам. Для микроорганизмов данного рода характерными являются следующие признаки: тонкие, пря­мые или слегка изогнутые палочки размером 0,2-1,0´2,5 мкм; часто образуют нити длиной до 10-50 мкм. Особенность актиномицетов — способность образовывать хорошо развитый мицелий, у одних видов он длинный, редко ветвящийся, у других корот­кий и сильно ветвящийся; его нити не имеют перегородок (истинный мицелий). Палочковидные формы часто с утолщенными концами, в мазках располагаются одиночно, парами, V- или Y-образно, либо в виде палисада. Все морфологические формы способны к истинному ветвлению, особенно на тиогликолевой полужидкой среде. Окраску по Граму удерживают плохо; часто образуют зернистые либо четкообразные формы; конидий не образуют; кислотонеустойчивы. Факультативные аэробы и анаэробы; для хорошего роста как в аэробных, так и анаэробных условиях нуждаются в повышенном содержании СО2
. Хемоорганотрофы; фер­ментируют углеводы с образованием кислоты без газа: продукты ферментации — уксусная, муравьиная, молочная и янтарная кислоты (но не пропионовая). Синтез каталазы и способность к восстановлению нитратов варьируют у разных видов; индол не образуют, некоторые дают a-гемолиз на средах с кровью. Некоторые виды формируют нитчатые микроколонии, напоминаю­щие мицелий; на 7-14 сутки образуют видимые крошковатые S-колонии, иногда окрашенные в желтый или красный цвет. Оптимум температуры 35-37°С. Преимущественно обитают в рото­вой полости и на поверхности слизистых оболочек у млекопитающих, в том числе и человека: некоторые виды — почвенные сапрофиты; типовой вид — Actinomyces bovis.

Поскольку актиномицеты входят в состав микрофлоры полости рта и ЖКТ, то их следует рассмат­ривать как условно-патогенные микроорганизмы, их способность вызывать специфические поражения, соответственно. не выражена. Заболевания, вызываемые ими, обозначают термином «актиномикозы»: впервые их детально изучил Боллингер (1877) при поражениях крупного рогатого скота; первое описание поражений у человека привел Израэль (1878). Актиномикоз у людей отмечают редко; подавляющее большинство случаев вызывает A. israelii, и лишь в редких случаях выделяют A. naeslundii, A. odontolyticus, A. bovis и A. viscosus. Внутривидовая диффе­ренциальная диагностика актиномицетов основана на различиях в способности ферментировать углеводы и некоторых других биохимических тестах (табл. 13).

Таблица 13. Отличительные признаки видов Actinomyces

Признак	Вид
	A. viscosus	A. naeslundii	A. israelii	A. odontolyticus	А . bovis
Рост в аэробных	+	+	–	+	+
условиях
Серогруппа (ИФА)	В	Е	D	А	F
Микроколонии:
Гладкие	–	–	–	+	+
Паукообразные	+	+	+	–	–
Каталаза	+	–	–	–	–
Уреаза	+	+	–	–	–
Крахмал	–	–	–	–	+
Арабиноза	–	–	±	–	?
Инозит	+	+	+	–	?
Ксилоза	–	–	+	–	±
Маннит	–	–	+	–	–
Манноза	+	±	+	–	?

Распространение

Актиномицеты входят в состав нормальной анаэробной микрофлоры ро­товой полости, ЖКТ и влагалища (реже). Обладают, особенно Actinomyces israelii, выражен­ной адгезивной активностью на слизистых оболочках и способностью к быстрой колониза­ции. Актиномикозы регистрируют практически во всех странах мира; больные составляют до 2,5-10% всех пациентов с хроническими гнойными процессами различной локализации; мужчины болеют почти в 2 раза чаще, чем женщины. Основные предрасполагающие факто­ры — травмы ротовой полости, периодонтиты, различные стоматологические (и другие ме­дицинские) манипуляции; реже актиномикозы бывают осложнениями аппендэктомий, холецистэктомий, ранений кишечника или язв двенадцатиперстной кишки. Наибольшее число случаев регистрируют в осенне-зимний сезон, что связано с ростом частоты простудных заболеваний, обусловливающих благоприятный фон для развития актиномикозов.

Морфология и культуральные свойства возбудителя

Actinomyces склонен образовывать длинный ветвящийся мицелий (средние размеры нитей 3-10´0,6 мкм), со вре­менем распадающийся на полиморфные (кокковидные, колбовидные и др.) элементы. На простых средах растет плохо, лучше — на белковых средах, дополненных сывороткой; обра­зует прозрачные бесцветные пастообразные, обычно гладкие колонии, плотно срастающиеся со средой; воздушный мицелий скудный; пигментов не образует; на некоторых средах (на­пример, на кровяном агаре) может формировать белые бугристые колонии, напоминающие коренные зубы.

Actinomyces odontolyticus на кровяном агаре образует красные колонии, окруженные зоной b-гемолиза. Все актиномицеты растут медленно, и посевы следует куль­тивировать в течение 7-14 суток (особенно при подозрении на инфекцию Actinomyces israelii).

Патогенез поражений

Поражения могут носить эндогенный (например, воспалительные процессы или травмы ротовой полости) и экзогенный (при имплантации возбудителя в рану) характер. Основной предрасполагающий фактор — снижение иммунитета организма (особенно активности защитных факторов на слизистых оболочках), обусловленное сопут­ствующей патологией (туберкулез, сахарный диабет), беременностью и др.; особое значение имеет состав микробной флоры, способной значительно усугублять тяжесть поражении. Возбудитель может диссеминировать лимфогенно и гематогенно (очень редко); наиболее часто отмечают инфекции тканей с низким содержанием О2
. Вокруг внедрившегося в подслизистую оболочку возбудителя формируется специфическая гранулема (актиномикома), содержащая колонии возбудителя (друзы). Позднее очаг распадается с развитием гнойного и фиброзного процессов; его развитие и локализация определяют дальнейшее распростране­ние процесса. Преимущественно наблюдают контактный путь распространения — по кратчайшей прямой (независимо от анатомических границ) по направлению к поверхности кожи с образованием дренирующихся абсцессов и эрозий.

Клинические проявления

Инкубационный период варьирует от нескольких суток до многих лет; клиническую картину актиномикозов определяют их локализация, период развития поражений и их характер (локальный, распространенный либо диссеминированный).

Наиболее частое поражение — актиномикоз частей головы, наблюдаемый у 55-60% всех больных актиномикозами и у 6-10% пациентов, страдающих воспалительными поражениями челюстей. Забо­левание протекает хронически, но часто осложняется присоединением вторичных бактериальных инфекций; возможны поражения кожи, мышц, лимфатических узлов, языка, слюнных желез и костных тканей.

10-20% всех поражений составляет торакальный актиномикоз: наиболее часто отмечают поражения легких, плевры, реже — мягких тканей грудной клетки.

Абдоминальный актиномикоз наблюдают у 25-50% пациентов; в большинстве случаев пер­вичный очаг локализован в слепой кишке и червеобразном отростке. Прогрессирование процесса сопровождается образованием массивных инфильтратов, симулирующих различные поражения кишечника — злокачественные новообразования, туберкулезный процесс; харак­терны необычайно обильное образование спаек и развитие спаечной болезни.

Сравнительно редкие поражения — актиномикоз мочеполовой системы, актиномикоз костей (возникает как кон­тактно, так и гематогенно), актиномикоз ЦНС (с развитием менингитов и менингоэнцефалитов) и генерализованный актиномикоз (типа метастазирующего сепсиса).

Лабораторная диагностика

Несмотря на отсутствие особых сложностей, адекватное распознавание актиномикоза остается непростой задачей, что во многом обусловлено неин­формированностью клиницистов о его частоте. Наиболее распространенный метод лабора­торной диагностики — обнаружение друз Actinomyces в экссудате или гнойном отде­ляемом из очагов поражения; последние, иначе обозначаемые как серные гранулы (тельца Боллингера) размером в среднем 0,3-2 мм. Они образованы агрегатами мицелия, имеющими вид округлых или овальных базофильных масс с эозинофильными структурами на поверхно­сти. Иногда в мазках можно обнаружить четкообразные атипичные формы Actinomyces israelii, a A. meyeri представлен мелкими неветвящимися клетками. Веское подтверждение диагноза — выделение и идентификация возбудителя (рис. 10).

A
. bovis

Возбудитель актиномикоза крупного рогатого скота, реже других видов животных. Естественная среда обитания неизвест­на, предположительно, это слизистые оболочки ротовой полости или кишечник животных.

Морфология клетки и тинкториальные свойства типичны для ро­да. В препаратах из культур обнаруживаются грамположительные па­лочки, коккобактерии, палочки с утолщенными или разветвляющи­мися концами, могут присутствовать нити различной длины. В пора­женных тканях формируются друзы — скопление клеток с булавовидным утолщением на концах и расходящихся радиально из цент­ра друзы. Центральная часть окрашивается по Граму положительно, периферическая — отрицательно (Спесивцева, 1964).

Рисунок 10. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителей актиномикозов

Факультативный анаэроб, но в аэробных условиях без добавле­ния СО2
на плотных средах не растет.

На плотных питательных средах образует нитевидные микроко­лонии за 24 ч при 36°С; позднее — макроколонии диаметром около 2 мм, выпуклые, иногда с вдавленным центром, ровным или волнис­тым краем, непрозрачные, белые, серо-белые, кремовато-белые, ше­роховатые или гладкие, мягкие. Рост медленный, типичные колонии формируются к 14-15 дню культивирования. На кровяном агаре во­круг колоний может наблюдаться зона b-гемолиза. В жидких средах образует мучнистый осадок (Курасова, Костин, Малиновская, 1971).

Не образует каталазу, цитохромоксидазу, не редуцирует нитра­ты и нитриты, тест Фогес-Проскауэра отрицательный, с метиловым красным — положительный. Продуцирует Н2
S, не гидролизует ксантин, тирозин, твин-20, 40, 60, 80, крахмал, лецитин, гиппурат, гуанин, желатин, казеин, часть штаммов гидролизует эскулин. Не расщепля­ет мясо, не разжижает свернутую сыворотку, в молоке образует кис­лоту, пептонизации нет. Образует ДНКазу (но не липазу и гиалуронидазу). Не деаминирует аргинин, аланин. Расщепляет сахарозу, часть штаммов — мелибиозу, инертен по отношению к раффинозе, рамнозе, салицину, рибозе, сорбиту, трегалозе, ксилозе.

В эксперименте при подкожном, внутрибрюшинном и внутривен­ном заражении культурой восприимчивы мыши.

A
. viscosus

Вызывает некоторые формы актиномикоза у челове­ка, его изолируют при актиномикозе свиней, собак, кошек. Естест­венная среда обитания — слизистые ротовой полости.

Морфология клетки соответствует общей родовой характеристике.

Факультативный анаэроб. Температурный оптимум 35-37°С. На плотных средах хорошо растет в обычных аэробных условиях и с по­вышенный содержанием СО2
, в анаэробных условиях не растет без наличия в атмосфере СО2
.

Микроколонии нитевидные. Макроколонии диаметром до 2 мм и более, плоские или возвышающиеся, с ровным или волнистым кра­ем, с нитевидными отростками, прозрачные или непрозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые или гладкие, сухие, мягкие или мукоидные. Гемолитической активностью не обладает.

Образует каталазу. Тесты на редукцию нитратов, цитохромоксидазу, гидролиз эскулина, крахмала, твин-40, 60, закисление и свер­тывание молока, деаминацию аргинина, образование кислоты из мелибиозы, рибозы, салицина, крахмала, трегалозы варьируют в зави­симости от штамма. Положительные реакции с метиловым красным, раффинозой, сахарозой, на сероводород (TSI-arap).

Отрицательные реакции на редукцию нитритов, Фогес-Проскауэра, на гидролиз аденина, казеина, желатина, гуанина, гиппурата, гипоксантина, лецитина, твин-20, -80, тирозина, ксантина. Сыворотку не раз­жижает, казеин молока не пептонизирует, липазы, ДНКазы, гиалуронидазы не образует. Не деаминирует аланин. Не образует кислоты из мелецитозы, рамнозы, сорбита, сорбозы, ксилозы.

Известны два серовара (1,2), отличающиеся по физиологическим характеристикам. В пределах данного вида выделяют группу атипичных штаммов. Близки по своим свойствам группы актиномицетов, имеющих статус промежуточных между видами A. naeslundii и A. viscosus.

В эксперименте патогенен для мышей и хомяков.

A
. hordeovutaeris

Обнаруживают при висцеральных абсцессах, пе­ритонитах, артритах у собак.

Морфология бактериальной клетки типична для родовой характе­ристики.

Факультативный анаэроб, растет на плотных средах в аэробных и анаэробных условиях при избытке СО2
в атмосфере. Температурный оптимум 35-37°С. Рост стимулирует добавление в питательные сре­ды 10—20% фетальной сыворотки крови.

Микроколонии нитевидные, макроколонии (14 дней культивиро­вания) размером около 2 мм, приподнятые, с волнистым краем, с нитевидными отростками, непрозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые, сухие или мягкие.

Обладает слабой каталазной активностью, гидролизует эскулин, образует кислоту из мелибиозы, раффинозы (слабо), трегалозы, кси­лозы, не утилизирует рамнозу и рибозу.

A
. pyogenes

Ранее вид описывали под названием Corynebacterium pyogenes. Обусловливает гнойные процессы у животных, в том числе маститы коров, перитониты свиней. Среда обитания — слизистые оболочки.

Морфология клеток типична для родовой характеристики.

Факультативный анаэроб. Температурный оптимум 35-37°С. На поверхности плотных питательных сред в анаэробных условиях рас­тет при избытке СО2
в атмосфере.

Нитевидные микроколонии не образует, макроколонии имеют диаметр около 2 мм и более, выпуклые, с ровными краями, непрозрач­ные, белые или серо-белые, гладкие, мягкие; вокруг колоний на кро­вяном агаре просматривается зона b-гемолиза.

Каталазу не образует, нитриты и нитраты не редуцирует, сероводород не образует, гидролизует казеин и желатин, не гидролизует аденин, эскулин, гуанин, гипоксантин, лецитин, твин-20, 60, 80, тирозин, ксантин. Часть штаммов гидролизует крахмал и твин-40. Молоко закисляет, свертывает, пептонизирует. липазу, гиалуронидазу не образует, синтезирует ДНКазу. Не деаминирует аланин, аргинин. Образует кис­лоту из рибозы и крахмала, часть штаммов расщепляет с образовани­ем кислоты мелецитазу, сорбит, трегалозу, ксилозу. Микроорганизм инертен по отношению к мелибиозе, раффинозе, рамнозе, салицину, сахарозе.

Фильтраты культур токсичны при внутреннем введении для лабо­раторных животных.

A. naeslundii, A. odontolyticus и A. meyeri изолируют при различ­ных патологических состояниях человека. О патогенности A. howellii., A. denticolens данных не имеется.

A
. suis

Вид с неопределенным положением. Изолируют при актиномикозе молочной железы свиней.

Бактериальные клетки представляют грамположительные палоч­ки дифтероидной формы, иногда кокковидной, V-, Y- или Т-формы, короткие или длинные нити.

Факультативный анаэроб. Температурный оптимум 35-37°С. На плотных питательных средах в аэробных условиях при избытке СО2
растет хорошо. В анаэробных условиях удовлетворительно растет без СО2
и при его избытке.

Колонии гладкие, непрозрачные, размером до 2 мм, выпуклые, центр может иметь углубление, края волнистые с отростками, цвет белый, серо-белый. Могут быть шероховатыми или гладкими, сухи­ми или мягкими.

Каталазу не продуцирует, нитраты редуцирует, тест Фогес-Проскауэра отрицательный, с метиленовым красным — положительный, желатин не гидролизует. Образует кислоту из раффинозы, салицина, крахмала, сахарозы, трегалозы, часть штаммов не образует кислоту из рамнозы, сорбита, ксилозы.

A
. humiferis

Обитатель почвы, имеет статус вида «incertae sedis». Патогенными свойствами не обладает.

Питательные среды для культивирования актиномицетов

Питательные среды и условия культивирования актиномицетов подбирают с учетом отношения конкретного вида к молекулярному кислороду, потребности в сыворотке крови и некоторых ростовых факторах.

Сердечно-мозговой бульон (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют мозгового отвара (су­хого) — 12,5 г, сердечного отвара — 5,0 г, протеазопептона — 10,0 г, декстрозы – 2,0 г, натрия хлорида—5,0 г, двунатриевого фосфата -2,5 г. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 15 минут.

Сердечно-мозговой агар. Готовят на основе сердечно-мозгового бульона, добавляя 2% агара.

Среды пригодны для культивирования A. israelii и A. bovis (Conant, 1950).

Czapek Dox-агар (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют натрия нитрата — 2,0 г, калия хло­рида — 0,5 г, магния глицерофосфата — 0,5 г, железа сульфата — 0,35 г, калия сульфата — 0,35 г, сахарозы — 30 г, агара — 12 г. Стерилизуют при 115°С 20 минут, рН 6,8.

Данная синтетическая среда рекомендуется для культивирования актиномицетов (Waksman, 1931).

Мальтозный (глюкозный) агар Сабуро (Кашнин, 1973). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют мальтозы (или глюкозы) — 4 г, пептона — 1 г, агар-агара — 1,8 г. Среду фильтруют, разливают по кол­бам, пробиркам и стерилизуют при 110°С 15 минут.

Для культивирования актиномицетов можно применять кровя­ной агар, среду Леффлера, тиогликолевые среды и среды, предназна­ченные для культивирования анаэробов, не содержащие специальных селективных добавок, например агар и бульон Шадлера (см. Питатель­ные среды для культивирования клостридий).

Во всех случаях надо учитывать, что A. pyogenes лучше растет на средах с кровью (сывороткой крови) и утилизируемыми углевода­ми, A. hordeovutaeris — с 15-20% фетальной сывороткой. Для изоляции ряда актиномицетов применяют питательные среды с селективными добавками.

Среда Бейгтона и Колмана (1976). Состав питательной среды: сердечно-мозговой бульон — 3,7 г, дрожжевой экстракт (порошок) — 0,5 г, поливинилпироллидон — 1,0 г, цистеин солянокислый — 0,1 г, агар — 1,5 г, вода дистиллированная — 100 мл. Компоненты раство­ряют, стерилизуют при 115°С 30 минут, охлаждают до 45°С и вносят 5 мл стерильной сыворотки крови кролика. Затем к 100 мл гото­вой питательной среды добавляют 1 мл раствора NaF (25 мг/мл), 0,5 мл стерильного раствора колистина сульфата (1 мг/мл). Эти раст­воры предварительно стерилизуют. Среду используют для культиви­рования оральных актиномицетов.

Среда Корнмана и Лоше (1978). В качестве основы используют обогащенную плотную среду. К основной среде добавляют метронидазол—10 мкг/мл и кадмия сульфат—20 мг/мл. Кадмия сульфат стерилизуют автоклавированием вместе с основной средой, метронидазол фильтруют и вносят в среду на последнем этапе. Среда реко­мендована для культивирования A. viscosus и A. naeslundii.

Fritsche (1964) выделил культуру A. israelii из контаминированного материала на неселективных средах благодаря предварительной специальной обработке материала.

Материал предварительно суспендируют в транспортной среде. Например, среде Syed, Loesche (1972) следующего состава: раствор 1 — 0,6% раствор К2
НРO4
, раствор 2 — 1,2% NaCI, 1,2% (NH4
)2
SO4
, 0,6% КН2
РO4
, 0,25% MgSO4
. Готовая среда содержит 75 мл раствора 1,75 мл раствора 2, а также 10 мл 1М раствора этилендиаминтетраацетата, 20 мл свежего 1%-ного раствора дитиотреитола, 5 мл 8%-ного раствора Na2
CO3
, 1 мл 1 %-ного раствора резазурина, 814 мл дистиллированной воды. Среду стерилизуют фильтрацией (рН 8,0).Исследуемый материал суспендируют в транспортной среде. 1 мл исследуемой суспензии смешивают с 1 мл толуола и встряхивают 20 минут. Водную фазу отсасывают пипеткой, добавляют к ней 10 мл транспортной среды, центрифугируют и осадок засевают на неселек­тивную питательную среду. Эффект обработки основан на ингибирующем действии толуола на грамотрицательные бактерии.

Микроорганизмы рода Pseudomonas

Представители рода Pseudomonas — прямые или слегка изогнутые палочки; средние размеры 0,5-1,0´1,5-5,0 мкм. Аэробы, метаболизм строго дыхательного типа (терминальный акцептор электронов — О2
), но некоторые виды используют нитраты в качестве альтернативных акцепторов электронов, что дает им возможность расти в анаэробных условиях. Многие виды аккуму­лируют поли-b-гидроксибутират в качестве резервного источника углерода (в мазках выявляет­ся в форме суданофильных включений). Хемоорганотрофы, некоторые виды — факультативные хемолитотрофы и используют Н2
и СО в качестве источников энергии. Подвижны (один или несколько жгутиков расположены полярно), кроме бактерий вида Pseudomonas mallei; спор не образу­ют. Большинство (если не все) видов не растут в кислой среде. Большинство окисляет глюкозу и другие углеводы (несахаролитические виды не способны к их окислению), а также каталазоположительны. Многие виды свободноживущие, либо считаются растительными и животными патогенами. Типовой вид — Pseudomonas aeruginosa. На основании гомологии РНК/ДНК изучаемые виды (их 27) Pseudomonas разделены на 5 гомологичных групп по структуре рибосомальной РНК и на несколько групп, имеющих гомологичную ДНК; соответственно предло­жено выделить из рода Pseudomonas некоторые микроорганизмы в роды Burkholderia, Stenolrоphomonas и др. Вполне очевидно, что иден­тификация возбудителя инфекции до уровня вида может принципиально изменить характер эмпирической терапии, что обусловлено, в первую очередь, различиями в их природной чувствитель­ности (устойчивости) к антибиотикам. Практическая необходимость видовой идентификации от­дельных представителей семейства Pseudomonadaceae также обусловлена задачами эпидемиологической, эпизоотической диагностики.

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка)

Один из основных возбудителей инфекционных поражений человека и животных, вызываемых псевдомонадами. Микроорганизм выделяют из кишечника 5% здоровых лиц и до 30% госпитализированных пациентов. Первое описание раневой инфекции, вызванной синегнойной палочкой, принадлежит Люке (1862), отметившему характерное сине-зеленое окрашивание перевязочного материала; в чистой культуре микроорганизм выделил Жессар (1882), изучивший его основные культуральные свойства. Первая вспышка госпитальной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, зарегистрирована в 1897 г (Багински), но уже в 1899 г С.Н. Серковский указывал, что патогенные свойства микроорганизма чаще реализуют­ся в организме лиц с ослабленным иммунитетом (детей и истощенных больных). Начиная с 70-х гг. Pseudomonas aeruginosa — один из основных возбудителей локальных и системных гнойно-воспалительных процессов, особенно в условиях стационаров. Более того, была показа­на патогенность синегнойной палочки для рыб, различных млекопитающих и даже растений.

Распространение

Pseudomonas aeruginosa распространена повсеместно, ее выделяют из почвы, воды, с растений и от животных (водных или обитающих в ареалах с повышенной влажностью). Вода имеет существенное значение в циркуляции возбудителя, в ней он может выживать до года (при 37°С), в том числе во многих растворах, применяемых в практичес­кой медицине и ветеринарии, вплоть до жидкости для хранения контактных линз. Иногда входит в состав нормальной микрофлоры человека; у здоровых индивидуумов Pseudomonas aeruginosa выяв­ляют на коже паха, подмышечных областей и ушей (до 2% лиц), на слизистой оболочке носа (до 3% лиц) и глотки (до 7%), в ЖКТ (3-24%). Поскольку возбудитель особенно обильно обсеменяет медицинское оборудование и циркулирует среди персонала и пациен­тов, то госпитализация существенно увеличивает колонизацию организма. Риск развития инфекции, вызванной синегнойной палочкой, существенно возрастает у больных с наруше­ниями барьерных систем и факторов резистентности. Инфицирование Pseudomonas aeruginosa вызывает до 15-20% всех внутрибольничных инфекций, считается одним из основ­ных возбудителей нозокомиальных пневмоний (до 20%), вызывает треть всех поражений моче­половой системы у урологических больных и считается причиной 20-25% гнойных хирургичес­ких инфекций и первичных грамотрицательных бактериемий. В большинстве случаев источник инфекции и путь передачи обнаружить не удается, т к. резервуарами возбудителя могут быть самые различные объекты (например, сырые овощи или букет цветов).

Часто синегнойную инфекцию наблюдают у больных с ожогами, заболеваниями мочевого пузыря, особенно у пациентов, длительно получающих антибиотики, что обусловлено выраженной устойчивостью возбудителя.

Одним из важных факторов инфицирования пациентов считается нарушение правил сте­рилизации, хранения и применения мочевых и сосудистых катетеров, игл для поясничных пункций, оборудования для обеспечения дыхания больного, а также различных ра­створов.

Высокий риск развития наблюдают как у лиц с иммунодефицитами (вызванными основ­ной патологией), так и у лиц, длительно получающих цитостатики, глюкокортикоиды и антибиотики.

Морфология и тинкториальные свойства возбудителя

Средние размеры - 1-3´0,5-1 мкм; в нативных препаратах подвижны (имеют один или два полярных жгутика). В мазках чис­тых культур расположены одиночно, парно, либо в виде коротких цепочек; в мазках из патологического материала их чаще можно обнаружить в цитоплазме фагоцитов, при этом палочки могут быть деформированы; в клиническом материале полиморфизм отсутствует, а каких-либо включений не наблюдают. Синтезирует крахмалоподобное вещество, покрывающее тонким слоем микробную клетку, но не формирующее мор­фологически очерченного слоя. Более вирулентные штаммы синтезируют повышенное его количество (мукоидные штаммы), что дает основание рассматривать слизь как фактор патогенности. Наиболее часто мукоидные штаммы выделяют из мокроты больных при заболеваниях легких (например, при бронхоэктатической болезни). Формируя капсульное вещество в пораженном организме, клинические изоляты могут легко терять это свойство в первых лабораторных генерациях. Обычно фиксированные препараты окрашиваются по Граму отрицательно.

Культуральные свойства

Растет в широком диапазоне температур (4-42°С), что указывает на способность длительно сохраняться в окружающей среде и противостоять защитному повы­шению температуры тела. Отличительная особенность — ограниченная потребность в питатель­ных веществах, обеспечивающая сохранение жизнеспособности в условиях почти полного отсут­ствия источников питания. При полном отсутствии углерода количество палочек и их ферментативная активность за неделю снижаются в 10-100 раз, при внесении минимальных количеств углеродсодержащих питательных веществ число палочек восстанавливается в корот­кие сроки. Pseudomonas aeruginosa хорошо растет на простых питательных средах в аэробных условиях при температуре 30-37°С, а также и при 42°С (что можно использовать как диффе­ренциально-диагностический признак). Образование слизи — характерная особенность; слизь придает характерную вязкость бульонным культурам и колониям мукоидных штаммов.

На жидких средах (например, пептонной воде, МПЖ, бульоне Хоттингера) образует характерную серовато-серебристую пленку; по мере старения культур возникает помут­нение среды сверху вниз.

На плотных средах (например, МПА, КА, среде Эндо, Левина, Плоскирева, ЦПХ-агаре) образует весьма разнообразные колонии; на средах Эндо и Плоскирева обычно выделяют колонии следующих типов:

– плоские, неправильной формы, иногда склонные к слиянию, с волнистыми краями;

– напоминающие S-колонии Escherichia соli;

– складчатые с неровной поверхностью («маргаритки»);

– слизистые или мукоидные колонии;

– карликовые или точечные, формирующиеся к 18-24 ч роста при 37°С.

При росте на плотных средах у многих штаммов наблюдают феномен радужного ли­зиса, развивающийся спонтанно. Феномен характерен только для Pseudomonas aeruginosa, его можно рассматривать как таксономический признак. Более того, он индивидуально выражен у отдельных штаммов, и его можно использовать для внутривидовой дифферен­циальной диагностики. При образовании пигмент окрашивает некоторые среды, напри­мер агар Мюллера—Хинтона или МакКонки, в зеленый цвет.

Биохимические свойства

Pseudomonas aeruginosa — выраженный хемоорганотроф; метаболизм дыхательный, никогда не бродильный; строгий аэроб. В качестве источ­ника энергии синегнойная палочка использует Н2
или СО. Универсальный акцептор элект­ронов — молекулярный кислород. Как и большинство патогенных гноеродных микроорганизмов, каталазоположительна. Подобно прочим аэробам, синтезирует цитохромоксидазу (индофенолоксидаза), а оксидазный тест — один из ведущих при идентифика­ции этой палочки. Синтезирует триметиламин, придающий культурам запах жасмина, винограда или карамели. Не нуждается в факторах роста. Способна расти на протяжении нескольких пассажей в чисто минеральной среде при добавлении подходящего единственно­го источника углерода. Ассимилирует ацетаты, пируваты, сукцинаты. Может утилизировать глюкозу, L-аланин при их содержании в среде не менее 0,5%.

Протеолитическая активность сильно выражена. Разжижает желатин, свертывает сыворотку крови, гидролизует казеин; утилизирует гемоглобин (большинство патоген­ных штаммов на кровяном агаре образует зону b-гемолиза). Синтезирует гиалуронидазу; гидролизует не только белки, но и отдельные аминокислоты (например, валин и аланин). Лизин и орнитин не декарбоксилирует; восстанавливает нитраты до нитритов и далее до молекулярного азота.

Сахаролитическая активность низкая; окисляет только глюкозу с образованием глюконовой кислоты.

Ввиду явного преобладания протеолитических свойств над сахаролитической активнос­тью для идентификации синегнойной палочки среды Гисса для пестрого ряда готовят с малым содержанием пептона (до 0,1%) и повышенной концентрацией углеводов (до 2%). При посеве можно наблюдать, помимо четкой реакции с глюкозой, непостоянную фер­ментацию фруктозы и маннита. Тест Хью-Лейфсона положителен только с глюкозой (в аэробных условиях).

Пиоцины. Pseudomonas aeruginosa продуцирует бактериоцины — пиоцины (аэругеноцины); способность к синтезу и чувствительность к ним широко варьируют у различных штаммов, на чем основано пиоцинотипирование псевдомонад, применяемое для внутривидовой дифференциальной диагностики культур. Вирулентные штаммы либо активно продуцируют пиоцины, либо подвержены их действию. В основу метода положены следующие положения.

1. Пиоцины различных штаммов по-разному действуют на индикаторные штаммы.

2. Штамм-продуцент пиоцина резистентен к образуемому им бактериоцину.

3. Различные штаммы обладают разной чувствительностью к набору индикаторных пиоцинов.

4. Пиоцинотипирование используют при эпидемиологической оценке выделенных культур. Для разделения культур на пиоцинотипы используют два основных методических принципа.

– Типирование по продукции или активности пиоцинов в отношении набора индикаторных штаммов.

– Типирование по чувствительности штаммов к наборам известных индикаторных пиоцинов. Соответственно культуры получают наименования: «пиоцинотип» — штамм или культура, подверженная литическому воздействию определенного типа пиоцина; «пиоциногенотип» — штамм или культура, образующая определенный тип пиоцина.

Пигментообразование

Характерный и имеющий важное диагностическое значение признак (у 70-80% клинических изолятов). Среди пигментов наиболее часто встречают:

а. Водорастворимый феназиновый пигмент пиоцианин, окрашивающий питательную сре­ду, отделяемое ран и перевязочный материал в сине-зеленый цвет. В анаэробных услови­ях пигмент обычно бесцветный, но даже встряхивание среды (частичная аэрация) приво­дит к появлению окраски.

б. Подавляющее большинство культур образует зеленый пигмент флюоресцеин, или лиовездин, флюоресцирующий при УФ-облучении (с длиной волны 254 нм); для обнаруже­ния можно воспользоваться лампой Вуда.

в. Некоторые штаммы могут синтезировать и другие пигменты — пиорубин (красный), пиомеланин (черно-коричневый), L-оксифеназин (желтый).

г. Оптимальная температура для синтеза пигментов in vitro 30-37°С. Кроме того, необходи­мо дополнение сред глицерином, аминокислотами (особенно аланином), ионами (особен­но Mg2+
и К+
). Высоковирулентные штаммы отличает значительное образование пиоцианина, проявляющего свойства бактериоцина, действующего на грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также имеющего умеренную фунгицидную активность.

д. При выделении культур иногда наблюдают атипичные непигментированные или слабопигментированные формы. Обычно их идентификация требует дополни­тельного тестирования, что усложняет диагностические исследования. Непигментированные штаммы составляют 8,3-18%, а 6-37% всех изолятов может быть пигмен­тировано слабо.

Основные механизмы изменчивости культуральных признаков Pseudomonas aeruginosa — лизогенная конверсия и мутации.

Отсутствие или утрата способности к пигментообразованию также могут обусловливать сопут­ствующая микрофлора, действие антибиотиков, дефицит О2
или смена среды обитания с нару­шением физиологических свойств бактерий, вызванных искажением белкового метаболизма в патологически измененных тканях, особенно при злокачественных новообразованиях.

Пиомеланин предохраняет микроорганизм от неблагоприятного действия изменений концентра­ции О2
и УФ-лучей. Его наличие также помогает бактериям переносить гипоксию при инфекци­ях глубоких тканей. Подобные свойства пигмента дают основание считать меланинобразующие штаммы более вирулентными.

Патогенез

По сравнению с Pseudomonas aeruginosa, подавляющее большинство микро­организмов данной группы,
обитая в почве и воде, имеют ограниченное клиническое значение (за исклю­чением В. mallei и В. pseudomallei —
возбудителей сапа и мелиоидоза соответственно). Высокая частота выделения и бо­лее выраженная патогенность Pseudomonas aeruginosa связаны с наличием у этого микроорганизма ряда факторов вирулентности, способству­ющих колонизации и инфицированию тканей организма человека. К детерминантам вирулентности относятся факто­ры, способствующие адгезии, инвазии, цитотоксичности.

Адгезия Pseudomonas aeruginosa к клеткам эпителия опосредуется ворсинками (пилями), которые обладают способностью специфически связываться с GM-1 ганглиозидными рецепторами эпителия. Секретируемый микроорганизмом фермент нейраминидаза, отщепляя остатки сиаловых кислот от рецептора, облегчает специфическую адгезию.

Локальное и системное действие на организм млекопи­тающих оказывают и другие секретируемые Pseudomonas aeruginosa ферменты. Фосфолипаза разрушает цитоплазматические мембраны эукариотических клеток, инактивирует опсонины, гидролизует сурфактант легких. Цитотоксическим действием (в том числе и в отношении макрофагов), а также способностью подавлять биосинтез белка обладает экзотоксин А. Биосин­тез белка ингибируется также экзоэнзимом S. Эластаза (протеаза II) раз­рушает иммуноглобулины и компоненты комплемента, ингибирует активность нейтрофилов. Функцию нейтрофилов и лимфоцитов подавляет токсин – лейкоцидин. Цитотоксичес­ким эффектом обладает и пигмент пиоцианин, обусловли­вающий сине-зеленую окраску среды при выращивании микроорганизма в культуре или гнойного отделяемого ин­фицированных ран.

Мощным индуктором системной воспалительной реак­ции является липополисахарид Pseudomonas aeruginosa.
Часть штаммов продуцируют капсульный полисахарид альгинат. Штаммы, проду­цирующие альгинат, обычно выявляются у пациентов с хро­ническими инфекциям. Альгинат способствует формированию на поверхности эпителия пленки, которая обеспечивает защиту патогена от воздействия факторов резистентности макроорганизма и антибиотиков.

Для Pseudomonas aeruginosa характерно разнообразие весьма тонких меха­низмов регуляции экспрессии факторов вирулентности. Ак­тивность механизмов регуляции направлена на быструю адап­тацию микроорганизма к меняющимся условиям обитания и обеспечение максимальной экономичности с энергетичес­кой точки зрения. При пребывании микроорганизма во внеш­ней среде факторы вирулентности не синтезируются, при попадании же во внутреннюю среду организма млекопитаю­щих начинается интенсивный синтез этих белков, способ­ствующих развитию инфекционного процесса. Сигналами для микроорганизма о попадании во внутреннюю среду могут быть изменения температуры, рН среды, контакт с мембра­ной эукариотических клеток. Распознавание таких сигналов осуществляют специфические рецепторы, локализованные в клеточной стенке микроорганизма. Передачу сигнала, обес­печивающего начало синтеза фактора вирулентности, от ре­цептора к гену, кодирующему белок, осуществляют двух­компонентные системы передачи сигнала. Такие системы действуют по принципу последовательной активации фер­ментов в реакции фосфорилирования и являются универсальными в регуляции вирулентности микроорганизмов. У Pseudomonas aeruginosa описаны двухкомпонентные системы, регулирующие образованиe ворсинок и синтез экзоэнзимов. Кроме регуляции синтеза факторов вирулентности на уровне от­дельных микробных клеток, у Pseudomonas aeruginosa регуляция происходит и на уровне популяции. Речь идет о феномене "кооперативной чувствительности" или "чувства кворума" (quorum sensing), заключающемся в накоплении в микробной популяции низ­комолекулярных соединении (гомосеринлактонов), осуще­ствляющих при достижении определенной концентрации депрессию синтеза большинства факторов вирулентности. Таким образом, экспрессия генов вирулентности оказыва­ется зависящей от плотности микробной популяции. Био­логический смысл феномена, вероятно, связан с коорди­нированным началом синтеза факторов вирулентности только после достижения микробной популяцией определенного уровня плотности. Регуляции на уровне кооперативной чув­ствительности у Pseudomonas aeruginosa подвержена экспрессия большинства факторов вирулентности и вторичных метаболитов.

У Pseudomonas aeruginosa описана система секреции протеинов (так называ­емая протеаза III), обеспечивающая не только выведение экзо­энзимов из внутренней среды бактериальной клетки, но и их транслокацию внутрь эукариотической клетки, то есть к чувствительным мишеням . К протеинам, секретируемым описанной системой, относятся и факторы вирулентности.

Таким образом, патогенное действие Pseudomonas aeruginosa в первую очередь обусловлено образо­ванием веществ, проявляющих свойства экзотоксинов, и высвобождением эндотоксинов при гибели и распаде бактериальных клеток.

Экзотоксины бактерий представлены продуктами жизнедеятельности с широким спек­тром биологической активности; среди них основное значение имеют:

Экзотоксин А — белок с Mr
66 000-72 000 Да; молекула токсина состоит из одной полипептидной цепи с 4 дисульфидными связями; свободных сульфгидрильных групп не содержит. Характерные особенности: наличие аргинина в качестве N-концевой аминокислоты и высокое содержание кислых аминокислот. Токсин термолабилен, рас­щепляется трипсином, панкреатической эластазой, проназой, а также под действием собственных протеолитических ферментов. Для синтеза in vitro необходимы хорошая аэрация и соответствующая температура (оптимум 32°С). Механизм действия свя­зан с модификацией белков через АТФ-рибозилирование. Его мишень — фактор элон­гации 2 (ФЭ-2); следствие — нарушение организации матрицы белкового синтеза (аналогичным свойством обладает дифтерийный токсин). Действие на подопытных животных превосходит токсичность всех остальных продуктов синегнойной палочки и проявляется в общем токсическом действии, отеках, некрозах, гипертензии с последую­щим коллапсом, метаболическом ацидозе, дыхательной недостаточности, параличе внут­риклеточного синтеза белков и т.д. Гистологически выявляют печеночно-клеточный не­кроз, геморрагические поражения легких, тубулярный некроз почек и т.д.

Экзоэнзим S — белок с АДФ-трансферазной активностью; термостабилен; инактивируется под действием денатурирующих и восстанавливающих агентов, ионов Cu2+
и Fe2+
; AT к экзотоксину А его не нейтрализуют. Образуется в двух формах: первая — ферментативно активный белок с Мr
49 000 Да; вторая — неактивный белок-предше­ственник с Mr
53 000 Да. В виде очищенного детергентами препарата нетоксичен для животных (очевидно, инактивируется при очистке); in vivo вызывает глубокие патоло­гические процессы в легких.

Цитотоксин оказывает выраженное цитотоксическое действие на полиморфноядерные нейтрофилы (первоначально назывался лейкоцидином, но позднее установлено патологическое действие на любые клетки); способствует развитию нейтропении. Вызывает ультраструктурные изменения в клетках, нарушения физиологических гра­диентов К+
, Na+
, Са2+
и глюкозы через повышение проницаемости клеточных мембран; последнее обусловливает набухание клеток и потерю крупных (например, белковых) молекул. Данный токсин синтезирует 96,7% культур патогенных штаммов.

Гемолизины. Микроорганизм образует две гемолитические субстанции — термо­лабильный гемолизин с лецитиназной активностью (указанный выше как фосфолипаза С) — белок с необычно высокой для бактериальных фосфолипаз мо­лекулярной массой (78 000 Да) и термо­стабильный гемолизин - гликопептид, состоящий из L-рамнозы и 1-b-гидрооксидеканоиновой кислоты.

Сочетанное образование обоих продуктов предполагает их функциональное взаимо­действие: гликолипид подобно детергенту трансформирует фосфолипиды в раствори­мые формы (субстрат для фосфолипазы С), потенциируя тем самым ее активность. Эффективному высвобождению фосфатов способствует параллельный синтез бакте­риальной щелочной фосфатазы. Такое действие вызывают солюбилизацию и гидролиз фосфолипидов с образованием фосфорилхолинов — источника неорганических фосфатов; гемолизины приводят к развитию некротических поражений (особенно в печени и легких). Гемолизины продуцируют все клинические изоляты.

Эндотоксин и фактор проницаемости. Среди продуктов жизнедеятельности микро­организма обнаружен энтеротоксический фактор - белковой природы, термолабильный, чувствитель­ный к действию трипсина. Его патогенетическое значение оценить трудно, т.к. инфекции Pseudomonas aeruginosa, сопровождающиеся диареей, отмечают крайне редко (шанхайс­кая, или пятидневная лихорадка). Вирулентные штаммы продуцируют фактор проницае­мости (также лабильный к нагреванию и действию трипсина), участвующий в развитии патологических процессов в тканях.

Другой продукт жизнедеятельности (очевидно, участвующий в формировании пораже­ний) — нейраминидаза (нарушает процессы метаболизма веществ, содержащих ненраминовые кислоты, например, в соединительно-тканных элементах). Нейраминидаза спо­собна в 2-3 раза усиливать действие других токсинов. Также следует обратить внимание на способность Pseudomonas aeruginosa синтезировать протеолитические ферменты (по крайней мере, 3 различные протеазы, отличающиеся по своим характеристикам и субстратной специфичности).

Протеаза I (нейтральная) образуется в очень незначительных количествах; данные о ее субстратной специфичности и участии в патологических процессах отсутствуют,

Протеаза II (эластаза) обусловливает 75% всей протеолитической активности; рас­щепляет эластин, казеин, гемоглобин, фибрин, Ig, комплемент и другие белки, но слабо действует на коллаген. Мишень — пептидные связи между гидрофобными ами­нокислотами. Относится к металлопротеиназам и инактивируется хелатами, ионами тяжелых металлов и сывороточным b-макроглобулином. Синтезируется как связанный с клеткой профермент, аккумулирующийся в периплазматическом пространстве. Активируется путем ограниченного протеолиза щелочной протеазой или готовой порци­ей эластазы. Обнаружена у 85% штаммов.

Протеаза III (щелочная протеаза) гидролизует многие белки (в том числе g-интерферон), но не расщепляет эластин; внутривенное введение очищенного препарата вызы­вает кровоизлияния практически во всех внутренних органах; внутрикожное введение приводит к местным, позднее некротизирующимся кровоизлияниям.

Коллагеназа вызывает гидролиз коллагена в соединительных тканях. Основной фак­тор вирулентности при инфекционных поражениях роговицы.

Антигенная структура

Основные диагностически значимые Аг Pseudomonas aeruginosa -соматический О- и жгутиковый Н-Аг. Серологическую идентификацию культур и выяв­ление их принадлежности к определенному серотипу (серовару) проводят по наличию у выделенной культуры сочетания группоспецифичного О-Аг и типоспецифичного Н-Аг.

О-антигенный комплекс — ЛПС с белками и липидами клеточной стенки. ЛПС эндотоксина образует типо- или группоспецифический термостабильный О-Аг, на основе структуры которого проводят серологическое типирование, т.е., он основной структурный компонент О-Аг, обусловливающий его спе­цифичность.