ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ
ГОУ Лицей 1553 «Лицей на Донской»
Курсовая работа на тему:
«Изучение интенсивности углеводного обмена в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae в зависимости от типа углевода»
Ученицы 9 класса:
Немовой Екатерины
Научный руководитель:
Санин Иван Анатольевич
Москва
2010-2011г
Содержание
Введение_______________________________________________________2
Дрожжевая клетка_______________________________________________2
Метаболизм дрожжей____________________________________________5
Углеводы. Общие сведения_______________________________________7
Цели, методы, гипотезы, задачи___________________________________8
Ход работы____________________________________________________9
Полученные результаты и их обсуждения__________________________10
Выводы_______________________________________________________11
Библиографический список______________________________________12
Приложения __________________________________________________13
Введение:
По-видимому, дрожжи были первыми микроорганизмами, которые человек стал использовать для удовлетворения своих потребностей. Основное свойство дрожжей, которое всегда было привлекательно для человека- это способность к образования сравнительно больших количеств спирта из сахара. Первое упоминание о получении спиртных напитков в Египте, так называемой «бузы» можно считать началом современного пивоварения 6000 год н.э. Этот напиток получали в результате сбраживания пасты, получаемой при раздавливании и растирании проросшего ячменя. Из Египта эта технология попала в Грецию, а оттуда - в Древний Рим.
Виноделие, хлебопечение и пивоварение существуют уже несколько тысячелетий. Естественно, было выделено множество видов заквасок и проч. но мысль, что дрожжи-виновники брожения пришла в головы людям лишь в 19 веке. А 20 век вместе с сильным ростом промышленности увеличил область использования дрожжей. Они стали выращиваться в больших количествах в качестве источника витаминов и белка для сельскохозяйственных животных. Так же, дрожжи - основной источник технического этанола. С помощью дрожжей сейчас получают большой спектр веществ, к ним относятся витамины, различные полисахариды, разнообразные ферменты, используемые в пищевой промышленности, глицерин.
Производство этанола.
Этанол широко используется в химической промышленности, как исходное соединение для синтеза многих веществ, как растворитель, экстрагент, антифриз и т.п.Велика вероятность того, что у этанола есть будущее в качестве топлива, он намного более экологичен, нежели бензин.
Крупномасштабное получение этанола в качестве топлива на данный момент происходит в странах Южной Америки, например, в Бразилии. В качестве источника углеводов используют сахарный тростник, а продуцентами являются Saccharomyces cerevisiae. Так же возможно получение этанола из отходов целлюлозно-бумажной промышленности, т.к. остатки древесины содержат множество пентоз.
Дрожжевая клетка.
Классификация и систематика дрожжей
.
В основу систематики дрожжей положены различия в способах размножения, спорообразования, в местах их обитания, в приспособлении к условиям существования и физиологические признаки. В настоящее время существуют:
I) система дрожжей Гийермона, охватывающая все дрожжи.
2) система дрожжей В. И. Кудрявцева, включающая только настоящие, т. е. спорообразующие дрожжи.
По Гийермону, дрожжи делятся на два семейства: I) семейство сахаромицетов Е(Saccharomycetaeeae), или настоящих дрожжей, к которому относятся все одноклеточные дрожжевые грибки, образующие споры, и 2) семейство несахаромицетов (Non Saccharomycetaeeae), объединяющее так называемые ложные дрожжи, или дрожжеподобные грибки, размножающиеся почкованием, но, не образующие спор. На основании различных признаков семейства делятся на подсемейства, роды, виды, расы. (различные штаммы дрожжей в рамках одного вида)
Дрожжевая клетка имеет все структуры, присущие любым эукариотических клеткам и, в то же время, обладает некоторыми особенностями, свойственными грибам, например, запасающее вещество у дрожжей - гликоген, а не крахмал растений. Дрожжевая клетка способна как к бесполому, так и к половому размножению.
Схема строения клетки — Saccharomyces ellipsoideus, no Роуз и Харрисон, 1969:
1 — ядро; 2 — ядрышко; 3 — центриоль; 4 — ядерная оболочка; 5 — митохондрии; 6 — липидные зерна; 7 — цитоплазматическая мембрана; 8 — вакуоль; 9 — метахроматическая корпускула; 10 — клеточная стенка: 11 — рубец от почкования; 12 — цитоплазма.
Морфология и бесполое размножение.
для характеристик дрожжевых грибов обычно используют макро- и микроморфологические признаки, первые(макроморфология) изучают визуально культуральные признаки, а вторые - с помощью микроскопа.
Макроморфология
характеризует рост культуры в жидких или на плотных средах. Эти признаки непостоянны, очень изменчивы сильно зависят от состава среды и условий культивирования, поэтому они имеют весьма ограниченное значение в систематике дрожжей. Но, тем немее, многие виды дрожжей существенно отличаются по характеру роста (например, в виде гигантской колонии), что дает возможность их быстрой предварительной идентификации. (Бабьева, Чернов 2004)
Микромофология
характеризует отдельные клетки, способы и образуемые структуры при вегетативном и бесполом размножении.
Типы вегетативного размножения у дрожжей делятся на 2 группы: бластический и артрический. При артрическом (таломном) способе мицелий дрожжеподобного гриба распадается на отдельные одноклеточные сегменты - артроспоры.
Бластический тип вегетативно размножения наиболее характерен для дрожжей, он заключатся в образовании почек. Сначала почка представляет собой вырост на материнской клетке, затем отделяется от нее, и на обоих клетках остается шрам. На материнской - «шрам почкования», который остается до самой смерти клетки, а на отделившейся-«шрам рождения», который в скором времени становится малозаметным.
Псевдомицелий.
Существует немало видов дрожжей, у которых дочерняя клетка после почкования не отделяется от материнской, а сама начинает почковаться, но и ее дочерняя клетка не отделяется и д.т. таким образом, дрожжевые клетки создают структуру, напоминающую мицелий., это называют ложным или псевдомицелием. Он отличается от истинного наличием хорошо заметных перетяжек, а так же концевые клетки всегда короче предшествующих, что тоже не малозаметно. Он бывает рудиментарным (состоящим только из клеток одного типа) и, соответственно, сложным (состоящим из клеток более чем одного типа, где различаются длинные клетки, составляющие псевдогифы, и расположенные гроздьями круглые, овальные или клиновидные почки.)
Рудиментарный мицелий - состоит из клеток одного типа
Сложный мицелий - состоит из клеток нескольких типов, обычно из удлиненных стволовых (псевдогифы) и более округлых мелких (бластоспоры).
Метаболизм дрожжей.
Метаболизм это биохимическая ассимиляция (в анаболических путях) и дисиммиляция (в катаболических путях) питательных веществ в клетке. Как и у многих других организмов, у дрожжей, эти процессы зависят от ферментативных реакций. Анаболические пути включают восстановительные процессы, в результате которых образуются новые структуры клетки, катаболические пути заключаются в окислительных процессах, использующихся для получения энергии.
В настоящее время хорошо известно, что большинство дрожжей используют сахар в качестве основного источника углерода и, следовательно, энергии, но существуют некоторые виды дрожжей, использующих нестандартные источники углерода.
При росте в аэробных условиях при низком содержании глюкозы в среде дрожжи получают АТФ за счет процессов дыхания, как это делает большинство аэробных организмов. Но при недостатке воздуха, а так же избытке сахара в субстрате (эффект Кребтри
), дрожжи переходят на более выгодный в таких условия процесс- брожение (окисление сахара до спирта и СО2, эффект
Пастера
) превращение глюкозы в пировиноградную кислоту в ходе гликолиза, и дальнейшее её превращение в спирт и СО2..
Дыхание.
При росте в аэробных условиях и низком содержании глюкозы дрожжи получают АТФ за счет дыхания, как и множество аэробных организмов.
Из углеродной цепи глюкозы, так же, как и из других углеводов, в результате образуется ацетил-КоА. В процессе гликолиза ряд последовательных реакций начинается с активации глюкозы. Взаимодействие глюкозы с АТФ, в результате которого образуется глюкозо-6-фосфат, эта реакция катализируется белком гексоиназой.
После этой подготовительной реакции происходит еще ряд подобных реакций, ведущих в конце концов к образованию группировки, которая способна к дегидрированию. Сначала происходит перестройка молекулы с образованием фруктозо-6-фосфата, а затем - перенос второй фосфатной группы с образованием фруктозо-1,6 – дифосфата и АДФ.
Фруктоза-1,6-дифосфат расщепляется ферментом альдолазой на два триуглеродный сахара: 3-фосфоглицериновый альдегид и диоксиацетонфосфат, которые могут превращаться друг в друга посредством фермента триозофосфатизомеразы.
3-фосфороглицериновый альдегид присоединяет еще один остаток фосфорной кислоты, за счет неорганического фосфата и образует 1,3-дифосфоглицериновый альдегид, который в присутствии (НАД) окисляется в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту.
В этой реакции принимает участие фермент триозофосфатдегид-рогеназа.
Образованная 1,3-дифосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфоглицерокиназы отщепляет один остаток фосфорной кислоты и передается на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфоглицериновой кислоты. Последняя, в присутствии фермента фосфоглицеромутазы изомеризуется в 2-фосфоглицериновую кислоту.
Под действием фермента фосфопируватдегидрогеназы 2-фосфо-глицериновая кислота превращается в фосфоэнолпировиноградную кислоту, а затем в присутствии фермента фосфотрансферазы фос-фоэнолпировиноградная кислота переходит в энолпировиноград-ную кислоту.
Спектр углеродных соединений, усваиваемых дрожжами при дыхании намного больше, нежели при брожении. Помимо того, что в присутствии кислорода многие дрожжи способны окислять пентозы (сбраживать их может очень малое количество дрожжей) но и многие дрожжи могут аэробно ассимилировать различные производные сахаров., например, сахароспирты сорбит ,инозит и проч.
Полисахариды могут усваивать только дрожжи, способные к синтезу соответствующих гидролаз. Так же довольно часто встречаются дрожжи, способные ассимилировать крахмал. Многие виды дрожжей способны усваивать инсулин (полифруктозан).
Более 20 видов дрожжей способны расти на метаноле в качестве единственного источника углерода и энергии. Но все виды таких дрожжей – факультативные метилотрофы, они так же хорошо растут и на углеводах.
Спиртовое брожение.
При росте в анаэробных условиях дрожжи превращают глюкозу в пировиноградную кислоту по гликолическому пути, получая 2 моля АТФ из 1 моля глюкозы. Процесс гликолиза включает реакцию окисления фосфоглицеринового альдегида, в которой образуется восстановленный пиридиннуклеотид НАД*Н. В анаэробных условиях в обычных условиях, последний окисляется через систему переноса электронов кислородом. В отсутствие же кислорода для сохранения окислительно- восстановительного равновесия необходимо окислить НАД*Н другим путем.
В дрожжевых клетках пировиноградная кислота п
Ход брожения может сильно меняться в зависимости от условий. Например, при добавлении в среду бисульфита, блокируется образование этанола, потому что, образующийся из пирувата ацетатальдегид связывается с бисульфитом, и образует бисульфитный аддукт. Для окисления НАД*Н дрожжевые клетки используют половину образующегося триозофосфата. Последний, восстанавливаясь, превращается в глицерин. Хотя при этом суммарный выход АТФ становится равным нулю, а, следовательно, такое брожение не может обеспечить рост клеток.
Все бродящие дрожжи способны сбраживать глюкозу и фруктозу, причина этого в том, что именно с этих сахаров начинается гликолитическое расщепление. В основном дрожжи способны сбраживать гексозы и олигосахариды, включающие остатки гексоз. Из моносахаридов, наиболее часто сбраживается галактоза, из дисахаридов – сахароза, мальтоза, трегалоза.
Некоторые дрожжи способны сбраживать полисахариды, состоящие из гексозных остатков. Например, Saccharomyc
opsis
fibuliger
могут сбраживать крахмал.
Дрожжей, способных сбраживать пентозы, очень мало,до 80-ых годов прошлого века, они не были известны (например, Pichia stipitis ), но вот окислять пентозы кислородом воздуха могут многие виды дрожжей.
Углеводы.
Классификация углеводов.
Углеводы
можно определить как альдегидные(карбонильная группа СОН) или кетонные (нарбонильная группа СО) производные полиатомных (содержащих более одной ОН-группы) спиртов или как соединения, при гидролизе которых образуются эти производные.
Согласно принятой в настоящее время классификации, углеводы подразделяются на три основные группы: моносахариды, олигосахариды и полисахариды.
Моносахариды
можно рассматривать как производные многоатомных спиртов, содержащие карбонильную (альдегидную или кетонную) группу. Если карбонильная группа находится в конце цепи, то моносахарид представляет собой альдегид и называется альдозой; при любом другом положении этой группы моносахарид является кетоном и называется кетозой.
Так же, это углеводы, которые не гидролизуются. В свою очередь, в зависимости от числа атомов углерода моносахариды подразделяются на триозы, тетрозы, пентозы
и проч.
Олигосахариды
- углеводы, гидролизующиеся с образованием двух (дисахариды) или нескольких молекул моносахаридов. Например,
С12Н22О11 + Н2О = 2С6Н1206
Дисахарид гексоза
Полисахариды
- углеводы, гидролизующиеся с образованием множества молекул моносахаридов, чаще всего глюкозы.
Задачи:
1. проанализировать доступную литературу по данному вопросу.
2. в одни и те же образцы питательной среды с дрожжами, содержащей минимум углеводов, например, желатин, добавить различные углеводы в одной и той же молярной концентрации.
3. произвести брожение
a. в отсутствии кислорода воздуха (с гидрозатвором)
4. через равные промежутки времени зафиксировать уменьшение массы образцов за счет выделения СО2.
5. повторить несколько раз эксперимент.
6. проиллюстрировать в виде графиков.
7. проанализировать результаты.
Цель:
Исследовать усвояемость различных углеводов, а также их производных в клетках дрожжей Saccharomyces С. в анаэробных условиях.
Методы:
1. Анализ литературы.
2. Экспериментальное наблюдение за углеводным метаболизмом, а так же количественная оценка его продуктов.
3. Анализ полученных результатов.
Гипотезы:
1.При брожении дрожжи селективно усваивают углеводные субстраты.
2. Такие моносахариды как пентоацетилглюкоза, галактоза и арабиноза, а так же трисахарид рафиноза не будут усваиваться дрожжами.
3.Дрожжи смогут осуществлять брожение на глюкозе, мальтозе и сахарозе.
4. D-Сорбит, являющийся сахароспиртом, так же не сможет послужить субстратом для дрожжевого брожения.
Ход работы.
Было поставлено 2 эксперимента по следующей методике:
1. В аппарат Киппа поместить 50-60 г карбоната кальция, залить разведенной соляной кислотой, которую приготовить из 100 мл. конц. продажной соляной кислоты и необохдимого количество воды.
2. Подготовить 8 колб объемом 500 мл каждая, ополоснуть их кипятком.
3. Приготовить ацетатный буфер.
4. Разлить в колбы по 200 мл. питательной среды, приготовленной из желатина (10 г желатина поместить в небольшой объем воды, оставить на некоторое время, затем довести до на 1 л, нагреть до кипения, охладить до 50С).
5. Разлить в колбы по 50 мл буферного раствора. Померить рН среды.
6. Когда температура в колбах достигнет 30-35С поместить в каждую колбу по 3 г сухих дрожжей, хорошо встряхнуть и оставить на полчаса.
7. В колбы поместить углеводы, указанные в таблице, заполнить углекислым газом из аппарата Киппа , закрыть временно глухими пробками, осторожно круговыми движениями перемешать содержимое, промаркировать колбы и взвесить.
8. Удалив глухую пробку (пробки сложить так, чтобы в дальнейшем не перепутать!) к каждой колбе присоединить установку, создающую гидрозатвор.
9. Через два часа, газоотводные пробки сменить глухими, колбы осторожно круговыми движениями встряхнуть, для лучшего отделения газ и взвесить. Определить уменьшение массы.
10. Повторять взвешивания через некоторые промежутки времени да прекращения брожения.
| № |
Добавляемый субстрат |
Тип |
Масса, г |
| 1 |
контроль |
||
| 2 |
D-глюкоза |
м/c |
9.00 |
| 3 |
галактоза |
м/c |
9.00 |
| 4 |
арабиноза |
м/c |
7.50 |
| 5 |
сахароза |
д/c |
17.12 |
| 6 |
мальтоза |
д/c |
17.12 |
| 7 |
рафиноза |
т/c |
25.20 |
| 8 |
D-сорбит |
мн/c |
9.12 |
Полученные результаты и их обсуждение.
В результате проведенных опытов у нас получилось зафиксировать резную интенсивность процессов брожения дрожжей. Соответственно, разной интенсивности выделения углекислого газа, а так же была зафиксирована степень изменения массы образцов за счет процессов брожения, происходящих в образце.
На основе данного графика можно утверждать, что сахар, вызывающий наиболее активное брожение – мальтоза, что неудивительно, потому что как известно, мальтоза- солодовый сахар, наиболее подходящий данному виду дрожжей.
Субстрат не вызывающий брожение- D-cорбит, это можно объяснить тем, это сахароспирт, и его окисление энергетически невыгодно.
опыт 1
Известно, что сахара подразделяются на группы в зависимости от структуры и размера, но в рамках одной группы эффективность процесса сильно различалась (например, D-глюкоза и галактоза). Это происходит из-за того, что у данного вида дрожжей нет ферментов, нужных для ассимиляции данных сахаров.
Наглядно протекание процесса брожения иллюстрирует график выделения СО2
Выводы:
1. Дрожжи селективно усваивают углеводные субстраты, потому что у каждого вида дрожжей свой ферментативный набор, который не подходит для ассимиляции все типов углеводов.
2. Пентоацетилглюкоза, галактоза и арабиноза, а так же трисахарид рафиноза не смогли служить субстратом для брожение, что можно объяснить тем, что это энергетически невыгодно.
3Дрожжи смогли бродить на глюкозе и сахарозе, это связано с тем, что, сахароза дисахарид ,состоящий из глюкозы и фруктозы, глюкоза же хорошо усваивается дрожжами, потому что с неё начинается гликолитическое расщепление.
4.мальтоза хорошо ассимилируется дрожжами, потому что у этих ферментативный набор этих дрожжей полностью подходит для мальтозы, например, у них есть фермент, гидролизующий мальтозу в глюкозу.
4. . D-Сорбит, являющийся сахароспиртом, так же не смог послужить субстратом для дрожжевого брожения. Это связано с тем, что процесс сбраживания D-сорбита невыгоден энергетически, даже в аэробной среде он протекал не очень активно.
Список использованной литературы:
1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. М: Товарищество научных изданий КМК, 2005, 221 с.
2. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М: Изд-во Моск.ун-та, 1987.
3.Николаев Л.А. Химия жизни. Пособие для учителей, Изд.2-е, перераб. М: Просвещение, 1977
4. Вилли К., Детье В. Биология. Биологические процессы и законы. М: Мир 1975
5. Берри Д.Биология дрожжей М.: Мир, 1985
6.http: //www.elsevier.com/locate/femsyr
Приложения:
Приложение1
.
Графики изменения масс образцов.
опыт 1
опыт2
Графика выдыеления углекислого газа.
опыт 1
опыт 2
Приложение 2
Методика приготовления ацетатного буфера.
1. Аппаратура, материалы и реактивы — по разд. 1:2. 2. Готовят 0.2 М раствор уксусной кислоты. Для этого 4,8 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 400 см3 дистиллированной воды. 3. Готовят 0.2 М раствор уксуснокислого натрия. Для этого .21,76 г уксуснокислого натрия растворяют в 800 см3
дистиллированной воды. 4. Растворы, приготовленные по пп. 2 и 3, соединяют в соотношении 3 :
7. Для этого 300 см3
раствора уксусной кислоты прилипают к 700 см3
раствора уксуснокислого натрия. 5. Ацетатный буфер должен иметь рН 5±0,05. Для корректировки значения рН используют избыточные объемы растворов.