Культура тканей и её использование человеком

МОСКОВСКАЯ ГОРОДСКАЯ ПЕДАГОГИЧЕСКАЯ

ГИМНАЗИЯ-ЛАБОРАТОРИЯ (МГПГЛ) №1505

Реферат

Культура тканей и её использование человеком

Выполнил

Балычев Глеб

Руководитель

Шалимова Е.Г.

Москва

2011

Оглавление

Вступительная часть 3

Цель: 3

Актуальность: 3

Задача: 3

Аннотация: 3

*немного из истории* 4

*немного о самом методе* 4

Базовые знания 5

Выделение клеток 5

Культуры клеток растений 5

Глава 1 6

Стерильность культуры 6

Лимит делений клеток 6

Точность концентрации веществ в питательной среде 7

Размер сосуда 7

Дифференцировка 8

Глава 2 9

Транспортировка 10

Проблемы при использовании метода: 11

Приложение 12

Практическое применение 12

Заключение 14

Список литературы: 15

Вступительная часть Цель:

Популярно рассказать всем желающим о методе культуры тканей в форме реферата. По возможности, максимально ясно и полно осветить данную тему, рассказать об истории развития медицины и науки в исследовании этой области.

Актуальность:

Недостаточная осведомленность учеников гимназии и большинства людей в целом по поводу метода культуры тканей. В нашей гимназии методу культуры тканей посвящено только один урок, да и то не целиком. В учебниках же этот метод упоминается только учебниках профильного уровня.Прочитав мою работу гимназисты и все другие желающие смогут ознакомиться с этой темой в большем объеме, прочитав заметно меньший объем текста — мой реферат.

Задача:

Основной задачей моего реферата является создание реферата, в какой-то мере освещающего эту весьма актуальную тему. Очевидно, что освещение этой темы полностью просто невозможно в форме реферата, поэтому я постараюсь изложить наиболее важные аспекты: метод культивации (как это делают), история развития метода, теоретические знания, связанные с использованием этого метода.

Аннотация:

Возможность поддерживать органы вне организма и даже выращивать организмы их отдельных систем клеток всегда была перспективной задачей. Уже в начале XX века ученые начали предпринимать первые попытки синтеза отдельных систем животных отдельно от организма - "в пробирке".На основе данных, полученных учеными, был создан метод выращивания и длительного сохранения в живом состоянии клеток, тканей, небольших органов - метод культуры тканей.Теоретически помощью метода культуры тканей возможно выращивание растений, имея всего несколько клеток этого растения. Также, возможно воссоздание живых существ, уже давно исчезнувших с лица Земли, имея лишь "законсервированого" представителя в колбе. В будущем метод культуры тканей сможет позволить исправить былые ошибки человечества!

*немного из истории*

Первые успешные опыты по Культуры тканей осуществил в 1907 американский учёный Р. Гаррисон, поместив в каплю лимфы кусочек зачатка нервной системы зародыша лягушки.

В 1910 году Раус индуцировал опухоль, использовав РНК вируса (вирус саркомы Рауса)

Однако сильнейший толчок в развитии этого метода произошел в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток.

Также, немаловажную роль в истории сыграл Джей. Он и его сотрудники получили первую перевиваемую культуру — HeLa.

Создателем одного из самых известных трудов по методу культуры тканей был Игл. Помимо крайне известной работы по этому методу, он открыл, что для поддержания клеток в живом состоянии требуются определенные низкомолекулярные бещества и немного белковой сыворотки.

В 1961 году ученым Хайфликом был открыт феномен, в последствии получивший его имя. Феномен заключается в том, что клетки (почти все) перестают размножаться после определенного числа делений (клеточных циклов).

Всего через несколько лет — в 1964 году, Като и Такеуши смогли вырастить растение (морковь), использовав клетку, полученную из корня растения.

Через год Харис и Уоткинс смогли индуцировать вирусом слияние клеток мыши и человека, получив при этом первые гетерокарионы клеток млекопитающих.

Гетерокарионы — клетки, содержащие два или более ядер, имеющих различные генотипы, которые получаются при слиянии соматических клеток.

Однако все, что выращивалось до 1968 года, было не так важно, так как именно в 1968 году учеными Августи-Точчо и Сато были получены нервные, мышечные и костные волокна. Возможно, в скором времени большинство органов и частей человеческого тела будут искусственно выращиваться, что полностью заменит потребность множества людей в ожидании донорских органов! Но в настоящее время выращивать органы в больших количествах просто невозможно. Происходит это из-за целого ряда причин (см. Главу 2)...

*немного о самом методе* Базовые знания

Для успешного выращивания клеток подходят не только стволовые клетки, однако они являются самыми часто используемыми. Причиной этому служит способность стволовых клеток регенерировать другие клетки (проще говоря, умение делиться) и их количество (у любого сложного организма они есть и часто разных видов).Стволовые клетки — типы клеток живых организмов, каждая из которых способна к асимметричному делению, в следствии которого образуется одна подобная материнской (стволовая) клетка и одна способная к дифференцировке. Учеными замечено, что с течением времени клетки, выделенные из организма начинают делиться все реже и реже.Это явление назвали феноменом Хейфлика - в честь ученого его открывшего. В настоящее время причину видят в том, что в соматических клетках отсутствует фермент-теломераза. И поэтому с каждым клеточным циклом происходит постепенное укорочение молекулы ДНК.

Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК.

>Теломераза содержит уплотненную цепь ДНК, что в последствии стабилизирует хромосомы, вызывает бессмертие клеток.

Однако не все клетки подчиняются этому закону. А именно клетки раковых опухолей. Из-за генной мутации в них активизируется ген теломеразы и они способны переносить неограниченное количество делений - жить вечно.

Выделение клеток

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом не утратить жизнеспособность.Однако, существуют «бессмертные» линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом мутации, но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путем активации гена теломеразы.

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в жидкой питательной среде, либо на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток требует соблюдения определенного баланса гормонов роста растений.Дифференцировка — процесс приобретения клетками особых признаков и свойств.

> Гены начинаю дифференцироваться из-за работы (или «отключения») определенных генов.

Глава 1

Основы успешного культивирования клеток.

Метод культивирования и выращивания живых клеток - относительно новая область современной биологии. Несмотря на многочисленные перспективы развития этой области, метод культуры тканей остается лишь придаточной технологией в медицине и фармацевтике.Культура клеток - технология, позволяющая в большинстве случаев, выращивать полноценную клеточную массу, не нуждающуюся в поддержке своей жизнедеятельности целым организмом. Иными словами - “самостоятельные” клетки, живущие in vitro - “в пробирке”.С помощью метода культивирования клеток возможно выращивание полноценного организм (растение), имея изначально лишь малую его часть.Несмотря на всю визуальную простоту этого метода, он остается одним из самых трудоемких и сложных. Основная сложность этого процесса заключается в чрезвычайно малых размерах объекта. Ведь мы работаем с объектами микромира из более привычного нам макромира! Помимо высокой точности производимых с препаратом клетки манипуляций, возникает еще целый ряд сложностей.

Стерильность культуры

Для успешного выращивания клеток требуется идеальная стерильность как самих выращиваемых клеток, так и питательной среды, в которой клетки содержатся.

Также для нормального роста питательный раствор надо периодически очищать от продуктов жизнедеятельности клеток (в том числе и токсичных) и от отмерших клеток.

Лимит делений клеток

Со временем у всех живых клеток на земле (кроме организмов одноклеточных и раковых опухолей, ), кончается “запас возможных делений”, что приводит к прекращению возможности клеток делиться и воспроизводить себе подобных. В природе это ведет к скорой гибели организма, в пробирке - абсолютно аналогично. Может быть, после прекращения возможности делиться клетка проживет еще весьма немалый срок, но для успешного увеличения количества клеток это совершенно бесполезно.

Чаще всего в лабораториях исчерпавшие свой “лимит делений” клетки отделяют от остальной клеточной культуры. Такие клетки для культивирования тканей чаще всего не нужны. Однако, если заранее известно, что культуру не собираются перевивать, скорее всего такие клетки оставят.

Фактором, определяющим лимит деления клеток, является фермент теломераза, а точнее отсутствие активности этого фермента. Фермент теломеразы отвечает за восстановление нормальной длинны молекулы ДНК после клеточного деления (митоза). Например, фермент теломераза “отключен” у всех живых клеток многоклеточных организмов, за исключением раковых опухолей, которым этот фермент не нужен, т.к. опухолевые клетки проскакивают период интерфазы (см. рисунок 1), делясь с большей скоростью.

В настоящее время учеными получена серия линий клеток, имеющих искусственно активированный ген теломераза. В отличии от опухолевых клеток, у которых этот ген активировался путем случайной мутации, у этих линий клеток он активирован специально.

Рис. 1. Схема основных этапов размножения клеток.

Точность концентрации веществ в питательной среде

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др.

Размер сосуда

С течением времени культура увеличивается в размерах до такой степени, что начинает уже касаться стенок сосуда. В этот момент можно пронаблюдать очень интересный процесс: клетки, касаясь стенок, начинают замедлять жизнедеятельность и теряют сверхважную функцию - способность делиться. На данный момент считается, что причиной этому служат определенные ферменты, сосредоточенные в клетке.

По сути своей, этот процесс для разведения клеток просто ужасен, однако именно благодаря этому процессу можно понять причину ограничения роста живых сущ

еств. Клетки “в пробирке” как-будто помнят, как надо себя вести в организме. Скорее всего, именно эти ферменты не позволяют нам увеличиваться до невероятных размеров!

Дифференцировка

Дифференцировка - процесс обретения клеткой определенной функции, задачи. Так какбд у каждой дифференцированной клетки есть узкая специализация, ограничивающая ее возможности, то клетка при этом теряет возможность делиться! А это обозначает полнейшую бесполезность этой клетки для культивирования.

Процесс разделения функций у клеток идет следующим образом. Сначала клетка делится (митозом) и получается две совершенно одинаковых клетки. Далее, только одна из новообразовавшихся клеток начинает обретать определенную функцию. Например, клетки крови образуются из красного костного мозга. При этом одна из образовавшихся клеток становится клеткой крови, а другая остается клеткой красного костного мозга.

Глава 2

Цели культивирования, способы их достижения и возможные проблемы.

Для разных целей требуются разные “типы” клеток. Например, для синтеза двух разных органов одному организму потребуются разные типы исходных клеток.Сравнивая эти типы клеток сразу найдется целый ряд отличий. Можно было бы предположить, что у разных органов разные функции, поэтому они и различаются. Так и есть. Однако, напрашивается вопрос: как и почему одна клетка становится например нейроном, а другая частью мышечной ткани?Объяснение этому процессу лежит внутри клетки. Основным фактором разделения клеток служат определенные градиенты. Градиентами чаще всего служат иРНК (информационная/матричная РНК).Градиент - закономерное изменение морфологических или функциональных свойств по одному из признаков на любой стадии его развития.Разумеется, при выращивании даже самых простых биологических материалов возникает целый ряд трудностей, зачастую весьма дорогостоящих, что приводит к нерентабельному производству, что в свою очередь снижает объемы продукции, поэтому перед учеными стоит очень важный вопрос: как снизить себестоимость выпускаемой продукции, будь то вирусная культура (например, вакцина), или будь то искусственный орган для имплантации.На сегодняшний день известны несколько клеточных культур, выращивание которых наиболее просто и наименее дорого:

В первую очередь, это опухолевые клетки. У них нет лимита делений, у них наибольшая скорость деления, у них нет интерфазы и т.д.

> Опухолевые клетки можно использовать в качестве чистого материала для исследования воздействия лекарственных препаратов на вирус возбудитель. Также облученные линии опухолевых клеток вводят в тело больного в процессе лечения, считается, что воздействие облученных определенным образом клеток способно нести эффект опухолевых антигенов.

Также, помимо опухолевых клеток, есть и другие типы клеток, способные жить почти бесконечно долго. А именно клетки почки собаки (MDCK) и фибропласты (3T3).

Далее идут клетки, поддающиеся культивации, однако с наибольшими затратами: клетки кости и хряща, мышечные клетки, эпителиальные клетки, нервные клетки, эндокринные клетки.

Как было сказано ранее, у опухолевых клеток есть ряд особенностей, обуславливающих успешный рост культуры, однако некоторые аналогичные функции можно встретить и у других клеток. Поэтому возникает вопрос: “Какую культуру выбрать: опухолевую или нормальную?

Преимущества типов клеток

Нормальная клетка	Опухолевая клетка
В основном культуры с ограниченным временем жизни	Большинство линий клеток бессмертны
Полиферация ограничена размерами посуды	Абсолютно неограниченная пролиферация клеток

> Пролиферация - процесс увеличения размера ткани путем увеличения количества клеток.

Разумеется, для выращивания разных видов и типов клеток требуются разные условия. Например, питательные среды:

> Для определения типа питательной среды нужно определить два фактора: тип культуры и планируемые исследования.

При выращивании культуры нейронов, мышечных клеток и некоторых эпителиальных клеток пластиковая поверхность покрывается желатином или коллагеном для придания ей положительного заряда.

Почти повсеместное распространение получил полистирол, обработанный таким образом, чтобы увеличить смачиваемость и придать поверхности отрицательный заряд.

Также немаловажное значение имеет посуда, в которой выращиваются клетки:

Главными факторами выбора посуды являются: требуемое количество клеток, требуемое количество слоев, порядок отбора образцов:

Чашки Петри довольно дешевы, удобны для окрашивания и сепарации клеток, однако весьма велик шанс заражения культуры и требуется особая концентрация веществ в воздухе.

Флаконы дороже Чашек Петри, зато герметичны, что не требует поддержания особого состава воздуха.

Также возможный параметр подбора посуды - объем планируемой культуры.

Транспортировка

При самостоятельной покупке клеточной культуры стоит помнить, что длительная транспортировка клеток происходит в замороженном состоянии, а именно в жидком азоте.

При перемещении культуры клетки могут легко повредиться, а также стоит постоянно поддерживать водный и воздушный баланс. Также не стоит перемещать культуру в не до конца заполненном клетками сосуде. В общем, перемещение культуры в не замороженном состоянии возможно только на совсем небольшие расстояния.

Проблемы при использовании метода:

Одной из главных проблем, с которой сталкивается метод культуры тканей - это материальная проблема. Процесс выращивания клеточных культур крайне сложен, дорогостоящ и трудоемок.Помимо этого, при использовании любого метода по замене органов и тканей имеется риск в “неудачности” операции. Когда-то пациентам сообщили, что если вероятность успеха, однако они слепо верят в эту вероятность, совершенно не думая о плачевности неудачной операции.Одной из решаемых проблем является неоднородность белков у пациента и клеточной культуры, что проявлялось в отторжении органа. Как уже сказано, объясняется это тем, что организм реципиента отвечает на трансплантат иммунологической реакцией. Эта реакция направлена на защиту от биологически инородных тел. Именно поэтому против любых чужеродных белков, в том числе против белков трансплантата, образуются антитела. Поиски путей преодоления тканевой несовместимости ведутся в следующих направлениях:

воздействие на трансплантат;

воздействие на реципиента;

На сегодняшний день попытки воздействия на трансплантат не дают должного результата, и единственным возможным путем являются способы снижения активности иммунитета на пациента.

В настоящее время существует ряд искусственных органов, не требующие борьбы с тканевой несовместимостью. Причиной этому служит само создание органа из белков пациента. Количество таких органов постоянно растет, однако зачастую выращивание такого органа может быть невозможно, из-за нехватки того или иного материала тканей самого пациента.

Приложение Практическое применение

Метод культуры тканей активно используются в научных исследованиях для выяснения и доказательства многих вопросов теоретической и практической биологии и медицины.Так, с помощью культуры тканей были детально изучены все стадии митоза. Этот метод был использован также для изучения дифференцировки клеток во время эмбрионального развития органов млекопитающих и птиц.Культуры тканей используются для решения многих вопросов цитологии, гистологии, эмбриологии, физиологии, онкологии. В тех случаях, когда у человека подозревается болезнь, связанная с нарушением числа хромосом, с диагностической целью культивируют клетки крови и в них подсчитывают число хромосом. Для решения проблем мутагенеза соматических клеток также используются тканевые культуры.

Цитология — раздел биологии, изучающий живые клетки, их органоиды, их строение, функционирование, процессы клеточного размножения, старения и смерти.

Гистология — раздел биологии, изучающий строение тканей живых организмов. В отличие от анатомии гистология изучает строение организма на тканевом уровне.

Эмбриология — это наука, изучающая развитие зародыша.

Физиология — наука о закономерностях функционирования и регуляции биологических систем разного уровня организации, о пределах нормы жизненных процессов и болезненных отклонений.

Онкология — раздел медицины, изучающий опухоли, их патогенез, механизмы и закономерности возникновения и развития, методы профилактики и лечения.

Патогенез — механизмы возникновения и развития болезни и отдельных её проявлений на различных уровнях организма.

С помощью метода культуры ткани создают вакцины против оспы, кори, полиомиелита. Также создаются лекарственные препараты ортосифона тычиночного, диоскореи дельтовидной, арника горного, различных видов раувольфии, женьшеня. Полученная культура женьшеня наиболее широко используется в парфюмерной промышленности, а культура раувольфина идет преимущественно на получение аймалина.

Аймалин - медицинский препарат, обладающий противоаритмической активностью (сердечной).

Недавно учеными были выращены «in vitro” такие части тела, как кость, сердечную мышцу, ткань головного мозга (нейроны), капиллярные сосуды, клетки печени, мочевой пузырь (первый полноценный орган), роговицу глаза, зуб, . Также, по некоторым источникам, удалось вырастить эмбрион человека, с использованием этого метода, однако точных доказательств этого нет. В любом случае это не будет законным, т. к. любые эксперименты с клонированием человека запрещены во всем мире.

Заключение

На сегодняшний день существует масса вакцин и лекарственных средств, основанных на методе культивирования тканей. Именно благодаря этому методу удалось подавить множество болезней. Например, полиомиелит был “побежден” благодаря вакцине, созданной из чистого вирусного материала, полученного методом культивирования.Метод культуры тканей на сегодняшний момент имеет широкое распространение в промышленном производстве вакцин и лекарственных препаратов, однако он почти не распространен в качестве метода по созданию организмов и органов. Основными причинами становятся трудность этого метода и этические устои, из-за которых многие не принимают этот метод как возможный. Однако, если учесть что этот метод уже неплохо развит, известен и экспериментально проверен, можно утверждать, что метод культуры тканей может получить еще более широкое распространение иже в ближайшем будущем.

Список литературы:

Игл. Основы культуры тканей.

Смолянинов А.Б. Клеточные и генные технологии в кардиологии. - СПб, 2009.

Рувинский А.О. Общая биология: учебник для 10-11 классов. Профильный уровень. - М..: Издательство "Просвещение". 2008.

Владимирская Е.Б. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М..Ж Медпрактика-М, 2005.

Хенч Л., Джонс Д. МИР биологии и медицины: Биоматериалы, искусственные органы и инженеринг тканей. - М.: Техносфера, 2007

1