МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное образовательное учреждение
высшего пРофессионального образования
ргау-мсха
имени К.А. Тимирязева
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ
КУРСОВАЯ РАБОТА
НА ТЕМУ:
"Роль биологического азота в азотном балансе почв"
ВЫПОЛНИЛ
: СТУДЕНТ II КУРСА
АГРОХИМИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА
ПРОВЕРИЛА
: доцент Годова Г.В.
Москва 2006г.
Аннотация
В теоретической части работе рассмотрены вопросы значения биологического азота в азотном балансе почв. Рассмотрены химизм биологической азотфиксации, основные группы бактерий-азотфиксаторов, их значение в сельском хозяйстве, методы изучения биологической азотфиксации, основные биопрепараты, направленные на усиление биологической азотфиксации. В практической части представлены результаты опыта по учету численности микроорганизмов в дерново-подзолистой почвы.
Курсовая работа содержит 33 страницы, 8 таблиц.
Содержание
Введение…………………………………………………….
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.Биологическая фиксация минерального азота………..
2.Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы и их роль в обогащении почвы азотом
а) значение азотобактера в практике с/х………….......
б) роль
Clostridium
в пополнении азотного фонда почв……..
в) значение других видов свободноживущих азотфиксаторов……
3. Симбиотические азотфиксирующие микроорганизмы, значение клубеньковых бактерий в агротехнике бобовых культур…………
4. Методы исследования биологической азотфиксации………..
5. Пути повышения эффективности биологической азотфиксации
а) агротехнические мероприятия……………………………….
б) применение бактериальных препаратов в земледелии……
6. Роль биологического и технического азота в земледелии бывшего СССР и других стран…………………………………………………………..
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ…………………………………………
Библиографический список…………………………………………
Введение
Безусловно, проблема биологического азота в земледелии на данный момент одна из самых актуальных в современном земледелии. Со времени открытия первых бактерий-азотфиксаторов и применения первых бактериальных препаратов прошло немногим более 100 лет, но за это время было сделано очень многое в этой отрасли сельскохозяйственной микробиологии. Однако до сих пор многие вопросы остаются нерешенными, в частности, вопрос о роли свободноживущих азотфиксаторов в азотном балансе почв.
Безусловно, применение бактериальных препаратов, направленных на биологическую фиксацию азота является эффективным и экологически чистым методом увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и пополнения азотного баланса почв. Но не следует забывать и про технический азот. Оптимальные объемы урожая и увеличение содержания доступного азота в почве возможно при грамотном сочетании этих статей баланса азота.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.
Биологическая фиксация азота.
В молекуле азота существует очень прочная тройная связь, которая обеспечивает инертность газообразного азота. Для перевода одной молекулы N2
в две молекулы аммиака требуется 225 ккал.
Биологический процесс восстановления азота представляет собой цепь ферментативных реакций, в которых главную роль играет фермент нитрогеназа. Активный центр этого фермента состоит из комплекса белков, содержащих железо, серу и молибден в соотношении Fe : S : Mo = 6 : 8: 1. Выделена также ванадийсодержащая нитрогеназа, уровень активности которой на 30% ниже, чем у Mo – нитрогеназы.
Азот, растворенный в воде, поступает в азотфиксирующий центр, где в его активации участвуют два атома молибдена. После взаимодействия с азотом молибден восстанавливается за счет электронов, поступающих в активный центр через Fe – белок и Mo-Fe-белок. Этот перенос сопряжен с реакцией разложения АТФ, т.е., он идет с затратой энергии. В передаче электронов нитрогеназе участвует железосодержащий водорастворимый белок – фермент ферредоксин, а в активации водорода воды и переносе протонов – фермент гидрогеназа.
Образование нитрогеназы у бактерий связано с наличием особых генов, содержащихся или в ДНК, или в плазмиде, ответственной за синтез этих специфических ферментных белков. Эти гены высоко консервативны и широко распространены у бактерий благодаря существованию эффективных систем обмена генетической информацией. В то же время диазотрофы не встречаются среди эукариот. Долгое время не обнаруживали азотофиксаторов и среди архебактерий. Однако в последнее время стало известно, что метаногены имеют особую термостабильную систему азотфиксации, отличную от термолабильной системы эубактерий. Таким образом, хотя свойство фиксировать азот присуще многим организмам, оно ограничено только царством прокариот.
У бактерий – азотфиксаторов встречаются все известные типы метаболизма. Среди них есть аэробы с дыхательным энергетическим обменом, анаэробы, осуществляющие брожение, хемоорганотрофы, автотрофы – фотосинтетики и хемолитоавтотрофы. Фиксация молекулярного азота для них не обязательный процесс, так как в присутствии азота в другой форме – минеральной или органической – они обеспечивают свои потребности связанным азотом.
Итак, если ранее считалось, что азотфиксация присуща лишь некоторым формам прокариотических организмов, то на данном этапе развития общей и почвенной микробиологии данный процесс считается фундаментальным свойством прокариот [Звягинцев и др., 2005]
2.
Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы и их роль в обогащении почвы азотом.
а) Значение азотобактера в практике сельского хозяйства.
К настоящему времени установлено, что многие свободноживущие бактерии – представители более 30 видов – способны фиксировать молекулярный азот. Большое значение в фиксации азота имеет семейство Azotobacteriaceae (бактерия Azotobacter Chroococcum, открытая М. Бейеринком и др.).
Молодые клетки азотобактера представляют собой палочки размером 2-3 х 4-6 мкм. Позже они превращаются в круглые кокки диаметром до 4 мкм. Кокковидные клетки обычно покрываются капсулой и содержат разные включения (жир, крахмал, и т. д.).
Иногда у кокковидных клеток появляется толстая оболочка, и они превращаются в цисты. На одних питательных средах палочки быстро приобретают кокковидную форму, на других – по истечении длительного времени. Палочковидные клетки азотобактера имеют жгутики и обладают подвижностью. При переходе палочек в кокки жгутики обычно теряются .
Все виды азотобактера аэробы. В качестве источника азота могут ассимилировать соли аммония, нитриты, нитраты и аминокислоты. При отсутствии связанных форм азота фиксируют молекулярный азот. Небольшие дозы азотосодержащих соединений не депрессируют фиксацию азота, а иногда даже стимулируют ее. Увеличение дозировки связанного азота в среде полностью подавляет усвоение молекулярного азота.
Энергия усвоения азота у отдельных культур азотобактера колеблется в широком диапазоне. Активные культуры связывают 15-20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.
Азотобактер обитает в высокоплодородных, достаточно влажных почвах с нейтральной или близкой к ней реакцией среды. При дефиците увлажнения большинство клеток этого микроорганизма отмирают. Во многих черноземах, каштановых и сероземных почвах, благоприятных для азотобактера, его обнаруживают в значительных количествах лишь весной. При летнем иссушении почвы в ней остаются лишь немногочисленные его зародыши. В зоне подзолистых и дерново-подзолистых почв азотобактер можно найти в огородных и пойменных почвах, богатых органическими соединениями, с благоприятным значением рН.
По предложению С. П. Костычева и его сотрудников с 30-х годов XX века в СССР начали применять землеудобрительный препарат, содержащий культуру Az. Chroococcum. Он рассматривался как аналог азотных удобрений. Позднее, когда выяснилась способность азотобактера продуцировать биологически активные вещества, его действие на растения начали связывать не только с процессом азотфиксации и улучшением азотного питания растений, но и с поступлением в растения вырабатываемых им биологически активных соединений (витаминов и стимуляторов роста). С азотобактерином в СССР была проведена очень большая работа, которая позволяет в настоящее время дать вполне определенный отзыв о целесообразности его использования в практике сельского хозяйства.
Создается вполне определенное впечатление, что для полевых культур азотобактерин малоэффективен. Опыты, поставленные в 1958-1960 гг., показали, что лишь в 34% случаев применение препарата давало прибавку урожая, но она была невысока и граничила с возможной ошибкой полевого эксперимента.
На унавоженных почвах положительное действие азотобактерина возрастает. Вполне благоприятно влияет этот препарат на овощные культуры, которые, как правило, выращиваются на сильно удобренных навозом почвах. В таких случаях бактеризация высеваемых семян может увеличить урожай на 20-30% и, что особенно важно, ускорить его созревание. [Мишустин Е. Н., 1972].
Азотобактер, безусловно, не может действовать как аналог азотных удобрений. Его благоприятный эффект на растения связан с продукцией биологически активных веществ и особенно фунгистатических соединений. Азотобактерин, очевидно, может с успехом применяться на богатых почвах как ростовой препарат.
б) Значение
Clostridium
в пополнении азотного фонда почвы.
Из анаэробных азотфиксаторов хорошо изучены представители рода Clostridium.
Первым из свободноживущих фиксаторов азота был открыт Clostridium pasterianum. Этот микроорганизм имеет палочковидные клетки длиной 1,5-8 мкм и шириной 0,8-1,3 мкм. Молодые клетки несут перитрихиально расположенные жгутики, старые – образуют споры. При спорообразовании клетки утолщаются в середине или на конце. В присутствии кислорода воздуха Cl. Pasterianum может развиваться только при наличии в среде аэробных бактерий, поглощающих кислород, он малочувствителен к реакции среды и встречается как в кислых (рН = 4,5-5,5), так и в щелочных (рН = 8-9) почвах. Споры его довольно устойчивы: они выдерживают нагревание до 960
С в течение нескольких минут.
В качестве источника азотного питания бактерии рода Clostridium могут использовать соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При дефиците этого элемента бактерии усваивают молекулярный азот. Источником углерода могут быть различные углеродсодержащие элементы – моно-, ди- и некоторые полисахариды, а также органические кислоты. Освобождающаяся при сбраживании углеводов энергия частично идет на усвоение газообразного азота атмосферы.
Бактерии рода Clostridium считаются слабоактивными фиксаторами азота. Пределом их активности считается связывание от 1 до 3 мг азота на 1 г сброженного сахара (но в лабораторных условиях, используя среды, физиологически оптимальные для этого рода, удалось повысить их активность до 10-12 мг азота на 1 г сброженного сахара [Мишустин Е.Н., Емцев В. Т.; 1987].
То есть в целом вклад Clostridium в азотный фонд почв невелик, но учитывая широкую распространенность бактерий этого рода в различных типах почв, полностью списывать его со счетов нельзя.
в) Значение других видов свободноживущих микроорганизмов в накоплении азота в почве.
Бактерии рода Beijerinckia, относящиеся к семейству Azotobacteriaceae, близки по свойствам к азотобактеру, отличаясь от него значительной кислотоустойчивостью, кальцифобностью и некоторыми другими свойствами. Они могут расти даже в среде с рН около 3. Эти бактерии широко распространены в кислых почвах субтропической и тропической зон. Реже они встречаются в почвах зоны умеренного климата. На территории бывшего СССР бактерии рода Beijerinckia найдены в красноземах Грузии. В окультуренных кислых почвах юга содержится больше клеток Beijerinckia, чем в целинных. Целинные луговые почвы в свою очередь богаче бактериями рода Beijerinckia, чем лесные.
Как показали исследования последнего времени, в почве могут находиться азотфиксирующие бактерии рода Klebsiella, представляющие собой грамотрицательные, подвижные с перитрихиальным расположением жгутиков, факультативно-анаэробные палочки. Они выносят довольно низкое значение рН и в большом количестве встречаются в лесных подзолистых почвах. В зоне умеренного климата они встречаются и под травянистой растительностью.
Бактерии рода Erwinia, населяющие надземную часть травянистых растений, также способны фиксировать молекулярный азот.
К азотфиксаторам также относятся и некоторые расы Pseudomonas fluorescenses (семейство Pseudomonadaceae). Этот аэробный микроб богаче представлен в почвах северной зоны.
К активным азотфиксаторам также относятся и аэробные цианобактерии. Можно считать, что все микроорганизмы этой группы, обладающие гетероцистами, способны фиксировать молекулярный азот. В почвах РФ обнаружено более 100 видов и разновидностей гетероцистных форм цианобактерий; из азотоусваивающих наиболее распространены представители рода Nostoc.
Цианобактерии распространены во всех почвенно-климатических зонах. Однако они предпочитают нейтральную реакцию среды, и поэтому их численность и видовой состав существенно возрастают в нейтральных почвах южной зоны. Многие цианобактерии живут в симбиозе с другими организмами (например, с грибами, образуя при этом лишайники). В неорошаемых культурных почвах наиболее благоприятные периоды для роста цианобактерий бывают весной и осенью, то есть в периоды увлажнения почвы, а в поливных, кроме того, и после орошения пашни.
Вклад свободноживущих азотфиксаторов в азотный фонд почвы весьма существенен. До последнего времени считали, что деятельность этих микроорганизмов не имеет особого значения в азотном питании растений. Однако длительные опыты опровергли эту точку зрения. Так, показано, что без применения азотных удобрений и без посева бобовых можно получить урожаи зерновых культур, для создания которых требуется внесение до 50 кг азота на 1 га. При этом к возможным источникам пополнения азота относятся деятельность свободноживущих азотфиксаторов и отчасти поступление этого элемента из атмосферы с дождевыми водами.
По материалам многолетнего опыта МСХА, на делянках бессменной ржи ежегодное азотонакопление при известковании почвы составило 28 кг/га, а на неизвесткованном фоне, где условия для азотфиксаторов были хуже – в 2,5 аза меньше.
По данным академика ВАСХНИЛ И. С. Шатилова, в неудобряемых дерново-подзолистых почвах в год связывается 19 кг азота, а в удобряемых – 32-37 кг/га. Данные С. М. Гуревича свидетельствуют о том, что на типичных черноземах без выращивания бобовых культур в год связывается до 56 кг азота на 1 га.
Микроорганизмы-азотфиксаторы, находящиеся на поверхности растений и использующие органические выделения растительных тканей, фиксируют в год 2-10 кг азота на 1 га.
3.
Симбиотические азотфиксирующие микроорганизмы: значение клубеньковых бактерий в агротехнике бобовых культур
Симбиотические азотфиксирующие микроорганизмы были выделены М. Бейеринком в 1888 году из корневых клубеньков (бородавчатых наростов) бобовых растений. Микроорганизмы назвали клубеньковыми бактериями, и было установлено, что они вызывают образование клубеньков, в которых осуществляется фиксация азота атмосферы. Бактерии в клубеньках питаются органическими соединениями, синтезированными растениями, а растение получает из клубеньков связанные соединения азота. Таким образом, между бактериями и растениями устанавливаются симбиотические взаимодействия.
Клубеньковые бактерии представляют собой грамотрицательные палочки 0,5-0,9 мкм шириной, 1-3 мкм длиной, подвижные, монотрихи с полярным с полярным или субполярным расположением жгутиков или перитрихи, аэробы. Спор не образуют. Быстрорастующие формы относятся к роду Rhizobium, медленнорастущие – к роду Bradyrhizobium.
Источником азота для клубеньковых бактерий служат разнообразные соединения – соли аммония и азотной кислоты, многие аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и т.д. Обычно клубеньковые бактерии фиксируют азот в симбиозе с растением. Однако на специальных питательных средах при отсутствии кислорода чистые культуры Rhizobium также способны усваивать некоторое количество молекулярного азота.
Клубеньковые бактерии используют разнообразные углеводы, в том числе и некоторые полисахариды (декстрин, гликоген). При усвоении углеводов в процессе жизнедеятельности некоторых видов образуются кислоты. Бактерии потребляют многие органические кислоты и многоатомные спирты.
Лучше развиваются клубеньковые бактерии в питательной среде с витаминами группы В. Ряд витаминов (тиамин, В12
, рибофлавин) и ростовые вещества микроорганизмы синтезируют сами.
Для большинства культур клубеньковых бактерий оптимальное значение рН среды находится в пределах 6,5-7,5, а при рН 4,5-5 и 8 их рост приостанавливается. Однако встречаются культуры, относительно устойчивые к кислой среде и образующие клубеньки в почвах с рН = 5. Оптимальная температура для большинства культур около 24 – 260
C, при температуре ниже 50
С и выше 370
С рост прекращается.
Внедрение клубеньковых бактерий в корень бобового растения-хозяина может осуществляться двумя путями: через верхушку корневого волоска или около его конца. У некоторых бобовых растений, например у арахиса, бактерии проникают через «расщелины» в основаниях боковых ответвлений корня. При таком инфицировании растение может быть заражено большинством видов клубеньковых бактерий, и можно говорить о низкой специфичности данного бобового растения. Бобовые растения, инфицируемые через корневые волоски, проявляют обычно высокую специфичность в отношении вида клубеньковой бактерии-симбионта.
Первый признак инфицирования растения – своеобразное изменение формы корневых волосков, которые изгибаются в виде ручки зонтика. Степень искривления волоска зависит от вида бобового растения, активности заражающего штамма, а также места проникновения бактерий. Искривление корневого волоска, по-видимому, объясняется тем, что прикрепившиеся к корневому волоску бактерии останавливают отложение плотного бета-слоя стенки клетки корневого волоска лишь в месте своего прикрепления, а образование этого слоя на противоположной стороне волоска продолжается. В результате корневой волосок сильно закручивается и бактерии оказываются внутри завитка.
В корневом волоске бактерии образуют так называемую инфекционную нить. Последняя представляет собой гифообразную слизистую массу, в которую погружены размножающиеся клетки клубеньковых бактерий. Нить передвигается к основанию волоска и клеткам эпидермиса. Такой путь, равный 100-200 мкм, она проходит за 1-2 суток. Затем нить из корневого волоска проникает через клетки коры в паренхиму.
После внедрения в растительные клетки инфекционная нить покрывается целлюлозной оболочкой, которая формируется из целлюлозной оболочки клетки, вероятно, для изоляции клубеньковых бактерий. Когда на пути инфекционной нити встречаются тетраплоидные клетки, часть бактерий переходит из нити в цитоплазму и начинает там размножаться. После инфицирования клубеньковыми бактериями растительная клетка, а также соседние незараженные начинают активно делиться. Усиленное размножение инфицированных клеток и находящихся под их стимулирующим влиянием (при участии ростового вещества) соседних незараженных клеток приводит к формированию ткани клубенька. Обычно инфекция распространяется через тетраплоидные клетки, а кора и проводящие сосуды клубенька образуются из диплоидных клеток.
Клетки клубеньковых бактерий, перешедшие в цитоплазму растительных клеток, растут, делятся, а затем трансформируются в своеобразные образования – бактероиды. Этим заканчивается процесс инфицирования – приблизительно через 3-4 недели после заражения. Бактероиды в 3-5 раз больше по размерам, чем обычные клетки, причем их форма меняется в зависимости от вида бобового растения – от шаровидной и грушевидной до вильчатой и ветвистой. Бактероиды не делятся, они составляют до 50% массы клубенька.
Ткань клубенька, заполненная бактероидами, обычно приобретает красноватую окраску благодаря пигменту леггемоглобину, родственному гемоглобину. Такая окраска характерна для клубеньков, активно фиксирующих азот. Леггемоглобин выявляют уже на второй день после образования клубенька, а фиксацию азота – на четвертый день.
По мере старения и дегенерации клетки отмирают. Определенную роль в этом процессе играет опробковение клеток сосудистой системы, задерживающее обмен питательными веществами между растением-хозяином и клубеньком. В клетках клубеньков появляются вакуоли, ядро перестает окрашиваться, а бактероиды лизируются. Лизис бактероидов по окончании активной жизни клубеньков обычно совпадает с с некрозом клубеньков, наступающим после цветения растения-хозяина.
У однолетних растений клубеньки также однолетние, у многолетних клубеньки могут функционировать в течение ряда лет. К концу сезона бактероидная ткань клубеньков разрушается, но клубеньки не отмирают, и на следующий год вновь начинают функционировать.
Количество клубеньков на корнях бобовых растений всегда более или менее ограничено. Клубеньки содержат больше азота, чем остальные части растения. Причем фиксация азота атмосферы осуществляется только в бактероидах, и около 90% связанного азота переходит из них в виде ионов аммония в цитоплазму клеток бобового растения. Передача связанного азота из тканей клубенька в наземную часть растения происходит в период, когда бактероиды жизнеспособны. Определенное количество усвоенного растениями азота выделяется корнями в почву с продуктами корневых выделений, например, с аминокислотами (аспарагиновой кислотой).
Эффективность азотфиксации симбиотической ассоциации бобовое растение – клубеньковые бактерии определяется наличием у клубеньковых бактерий целого комплекса симбиотических признаков:
· вирулентности – способности клубеньковых бактерий входить в контакт с корневой системой бобовых растений, проникать в ткани корня, размножаться в них и индуцировать образование клубеньков;
· азотфиксирующей активности – способности связывать азот атмосферы при помощи специальной ферментативной системы и превращать его в ионы аммония;
· эффективности – способности увеличивать урожай и содержание белка у бобового растения-хозяина за счет передачи растению фиксированного азота и синтезированных биологически активных веществ;
· конкурентоспособности – способности внесенного в почву определенного штамма клубеньковых бактерий образовывать клубеньки в присутствии других штаммов того же вида;
· специфичности – способности вступать в эффективный симбиоз с определенным набором сортов и видов бобовых растений.
Обычно почвы содержат в достаточно большом количестве клубеньковые бактерии тех видов бобовых растений, которых много в составе дикой флоры данной местности или которые длительное время там культивируются. Если в данной местности не произрастает определенный вид бобовых, то и свойственные ему клубеньковые бактерии отсутствуют. Поэтому для обеспечения эффективного симбиоза семена бобовых перед посевом заражают высокоактивными штаммами клубеньковых бактерий, специфичных для данного растения.
На количество клубеньковых бактерий в почве влияют ее свойства и состояние. Например, в нейтральных почвах бактерии размножаются лучше, чем в кислых, здесь часто встречаются активные формы. Окультуривание почв, особенно с внесением органических удобрений, улучшает условия для размножения клубеньковых бактерий.[Емцев В. Т., Мишустин Е. Н.; 2004]
В агротехнике бобовых культур большое значение имеет применение бактериальных препаратов рода Rhizobium, особенно если бобовые впервые высеваются на данном поле. После известкования почв высокими нормами известковых удобрений, увеличивающих рН на 1,5-2 единицы, целесообразна инокуляция всех бобовых культур более активными штаммами Rhizobium, так как на кислых почвах спонтанные штаммы обладают пониженной активностью.
Также для симбиотической азотфиксации очень важную роль играют микроудобрения, особенно бор и молибденсодержащие. О значении этих элементов говорилось в первой главе курсового проекта. Недостаток микроудобрений резко снижает, а иногда исключает фиксацию азота воздуха.
Все бобовые культуры охотнее ис
Таким образом, для научно обоснованного определения видов и норм удобрений под бобовые культуры необходимо не только знать каково содержание питательных веществ в почве данного поля, но также учитывать возможность обеспечения оптимальных условий для симбиотической азотфиксации. [Посыпанов Г. С. и др.; 1997]
4.
Методы исследования биологической азотфиксации
В настоящее время существует несколько методов изучения биологической азотфиксации.
Метод выращивания на питательных средах
применим в лабораториях. В данном случае бактерии-азотфиксаторы выращивают на средах с различной рН реакцией, содержанием элементов питания, температурными условиями и т.п. В данном случае возможно выяснить при каких условиях процесс азотфиксации идет наиболее оптимально, чтобы затем учитывать это в практике сельского хозяйства. Количество поглощенного азота можно учитывать с помощью метода меченых атомов. Однако недостатком этого метода является то, что он далек от производственных условий, и он является скорее общебиологическим.
Полевой и вегетационный методы исследований
значительно ближе к производственным условиям. В данном случае можно проследить динамику азотфиксации на разных типах почв при различных температурных режимах, освещенности, влажности, реакции среды. Эти методы исследований позволяют определить оптимальные для азотфиксации типы почв, подобрать оптимальные растения для симбиоза с бактериями - симбиотическими азотфиксаторами, проследить динамику содержания биологического азота в почве после уборке бобовых культур, и подобрать те растения, которые будут следовать за ними в севообороте, рассчитывать дозы азотных удобрений для тех культур, которые будут следовать за бобовым предшественником.
Весьма важными для повышения уровня биологической азотфиксации являются генетические исследования,
начатые в конце 50-х годов прошлого столетия. Генетико-селекционные основы азотфиксирующего симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями впервые в отечественной литературе были представлены в монографии «Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции», вышедшей в 1998 году под редакцией И. А. Тихоновича и Н. А. Проворова. Авторы отмечают, что многие растения, грибы и животные могут вступать в симбиоз с азотфиксаторами, что существенно расширяет экологические возможности как микросимбионта (который уходит от конкуренции с сапрофитной микрофлорой и получает доступ к легкоусвояемым источникам питания), так и хозяина (для которого открывается возможность жить в условиях дефицита или даже полного отсутствия связанного азота). [по Ягодину Б. А., 2004]
5.
Пути повышения эффективности биологической азотфиксации
а) Агротехнические мероприятия.
О некоторых из агротехнических мероприятий уже говорилось в предыдущих главах курсового проекта. В этом разделе мы обобщаем информацию о них.
Итак, для создания оптимальных условий для биологической азотфиксации необходимо соблюдать следующие мероприятия:
1. Создание оптимальных условий в почве для размножения и развития бактерий-азотфиксаторов. Сюда входят: изменение реакции среды до оптимальной за счет известкования, подбор необходимой структуры, либо улучшение ее за счет внесения органических удобрений, по возможности обеспечение почвы влагой в засушливых регионах, создание фона элементов питания, необходимых азотфиксаторам (в особенности по микроэлементам);
2. Корректировка доз азотных удобрений с учетом азотфиксирующей способности бактерий. Как уже говорилось выше, внесение минерального азота способно существенно снизить или даже свести на нет биологическую фиксацию молекулярного азота атмосферы. Поэтому в ряде случаев возможен даже полный отказ от внесения азотных удобрений (например, под зерновые бобовые культуры)
б) Применение бактериальных препаратов в земледелии
Биологической альтернативой минеральным азотным удобрениям является биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы. Как известно, азотные удобрения стали очень дорогими из-за сокращения добычи ископаемого топлива, а кроме того, в последнее время повышается общественно-политическая озабоченность возможностью химических загрязнений, в частности минеральным азотом, окружающей среды. Следовательно, внимание в настоящее время концентрируется на азотфиксации как альтернативе удобрениям.
Биопрепараты на основе азотфиксирующих бактерий обладают широким спектром действия, их использование позволяет снизить норму минеральных азотных удобрений, что положительно сказывается на уровне нитратов и нитритов в продукции.
В настоящее время выделяют несколько групп биопрепаратов – азотфиксаторов.
Биопрепарат ризотрофин на основе клубеньковых бактерий родов
Rhizobium
и
Bradyrhizobium
.
Препараты клубеньковых бактерий сейчас широко используются во многих странах. Использование этих препаратов совершенно необходимо, когда в данной местности вводят новые культуры бобовых, и в составе флоры нет перекрестно заражающихся с ними растений. Такая потребность, например, возникла в нашей стране при выращивании соевых бобов в новых зонах. При этом клубеньков на корнях бобовых растений практически не было. Инокуляция обеспечила образования клубеньков, а следовательно, и осуществление азотфиксации. В результате увеличились урожай и содержание белка в растительной массе и в зерне.
Значительно труднее решается вопрос о старопахотных, хорошо окультуренных почвах, на которых уже давно возделывают бобовые растения и можно предположить, что в таких почвах сложились уже достаточно стабильные микробные ценозы, в составе которых имеются и клубеньковые бактерии культурных бобовых растений. Нужна ли здесь инокуляция и будет ли она себя оправдывать?
Для ответа на этот вопрос были поставлены многочисленные опыты. В европейской части России массовые опыты с инокуляцией разных бобовых культур были проведены Е. Н. Мишустиным и В.В. Бернардом. В большинстве случаев инокуляция дала заметное увеличение урожая. Наилучший эффект отмечался на кислых почвах.
В последние годы под бобовые растения применяется около 1,5 млн. га порций ризотрофин в год. Ризотрофин позволяет уменьшить объемы применения азотных удобрений; препарат разработан практически для всех бобовых, возделываемых в настоящий момент. Агрономическая эффективность ризотрофина для бобовых культур составляет в среднем 10-30%, дополнительный сбор белка – 2-5 ц/га. При интродукции новых бобовых культур (люпин, люцерна, козлятник) эффективность бактеризации может составлять 50-100%, а сбор белка увеличивается в 2-3 раза.
Помимо ризотрофина существует ряд препаратов, созданных на основе свободноживущих бактерий-азотфиксаторов. О роли азотобактерина говорится во второй главе. Отметим здесь, что азотобактерин – очень нестабильный препарат и годен для использования лишь ограниченное время. Также разработаны препараты на основе культур цианобактерий, которые в основном применяются в тропических и субтропических зонах, а также на посевах риса, и препараты на основе ассоциативных азотфиксирующих бактерий (агрофил, мизорин, ризаргин, флавобактерин и др.).В подавляющем большинстве случаев такие препараты дают прибавку урожая в пределах 15-30%. При дозах минерального азота выше 60 кг/га, а также при недостаточном освещении положительного действия препаратов не наблюдается.
6.
Роль биологического и технического азот в земледелии бывшего СССР и других стран.
На данный момент биопрепараты очень широко применяются в тех странах, где активно занимаются экологическим земледелием (Германия, Франция и т.д.). Некоторые хозяйства в Западной Европе на данный момент полностью отказались от минеральных азотных удобрений в пользу биологического азота. В большинстве же стран биопрепараты применяются в комплексе с минеральными азотными удобрениями, а также в случае возделывания новых бобовых культур, о чем говорилось выше. Само собой речь здесь идет об экономически развитых странах, с применением интенсивных технологий растениеводства и земледелия.
В нашей стране до середины 80-х годов предпочтение отдавалось минеральным удобрениям. Биопрепараты использовались в основном при возделывании новых культур. В прошлой главе был описан пример с соевыми бобами. В конце 80-х ввиду резкого подъема экологического движения в нашей стране вопрос о биологическом азоте приобрел актуальность. Было множество предложений даже полностью отказаться от применения минеральных удобрений.
К сожалению сейчас в России в сельском хозяйстве просто нет средств для нормального развития, и многие хозяйства даже неспособны обеспечить необходимое количество минеральных удобрений, так что о биологическом азоте даже нет смысла говорить. Он используется лишь за счет азотфиксаторов, уже населяющих почву. Хотя в последние годы некоторые хозяйства смогли поднять уровень производства и соответственно начать применять различные биопрепараты.
Оптимальной будет являться та ситуация, при которой будет достигнуто совместное применение минеральных азотных, органических и биологических удобрений в необходимых количествах с сохранением бездефицитного азотного баланса почвы.
Практическая часть.
1. Объект и методы исследования
1.1. Характеристика взятого образца почвы.
Для данной курсовой работы была взята дерново-подзолистая почва, которая формируется в таежной зоне, подзоне южной тайги под лесной растительностью с чередованием разнотравных лугов. Водный режим здесь промывной. Почвообразующие породы представлены преимущественно лессовидными суглинками.
Ведущими процессами почвообразования являются дерновый и подзолистый. Сущность дернового процесса заключается в накоплении гумуса, аккумуляции биофильных элементов и формирование водопрочной структуры почвы под воздействием травянистой растительности.
В составе гумуса преобладают гуминовые кислоты. Благодаря мощному гумусовому слою с водопрочной комковато – зернистой структурой эта почва характеризуется высоким плодородием. Отношение Сг:Сф – 1,2-1,5. В дерново-подзолистой почве много элементов питания, в том числе микроэлементов, что обусловлено аккумуляцией N, P, K и S.
1.2. Методы биологического исследования почвы.
1.2.1.Отбор средней почвенной пробы для микробиологического анализа и требования к ней.
1. Образец должен быть «средней почвенной пробой»: среднюю пробу получают путем смешивания отдельных образцов почвы (со 100 м2
берут пробу из 3-х точек).
2. Образец должен отображать характеристику исследуемой почвы: если анализируют пахотную почву, то пробы следует брать с глубины всего пахотного слоя, снимая верхние 2 см почвы; если анализируют определенный горизонт или почву по профилю – пробу берут из определенного горизонта; если анализируют весь горизонт – пробу берут начиная с нижнего горизонта.
3.
Образец должен быть взят с соблюдением правил асептики (пробу берут стерильной лопаткой).
4.
Образец должен иметь четкую характеристику, откуда он взят.
5.
Образец должен быть свежим (анализируют в первые сутки после взятия).
6.
Образец почвы должен быть однородным (тщательно перемешанным).
1.2.2. Определение влажности почвы.
Необходимо определить влажность почвы, так как полученные данные анализа при оценке результатов должны быть пересчитаны на 1г воздушно – сухой почвы. Для этого сначала взвешиваем пустой бюкс, затем помещаем в него 10-20г почвы и взвешиваем. После сушки в сушильном шкафу при 105º и достижения постоянной массы бюкс с навеской почвы снова взвешивают и определяют содержание воздушно – сухой почвы в 1 г сырой.
Влажность (А) почвы лпределяют по формуле:
А%=
где b – масса бюкса с сырой почвой (32,2 г)
с – масса бюкса с сухой почвой (30,1 г)
а – масса пустого бюкса (19,6г)
А%== 20%
1.2.3.Учет численности микроорганизмов почвы.
Для учета численности микроорганизмов в почве применяют широко распространенный метод питательных пластин (метод Коха). Он позволяет учесть количество живых клеток в почве и выявить родовой и видовой состав, выделить чистые культуры бактерий. Но потребность в питательных веществах у различных микроорганизмов неодинакова, поэтому суспензию почвы высевают на разные среды (плотные и жидкие), предназначенные для различных физиологических групп микроорганизмов.
При посеве почвенной суспензии на жидкие питательные среды методом предельного разведения, численность микроорганизмов бывает несколько занижена.
1.2.4.Приготовление почвенной суспензии и посев на питательные среды.
Для проведения общего микробиологического анализа почвы, необходимо сделать посев микроорганизмов на плотные (МПА, КАА) и жидкие среды (среда Гильтая, среда Виноградского)
мясо – пептонный агар (МПА)
– учитывают количество сапрофитных микроорганизмов, использующие в качестве источника углерода органические соединения.
крахмало – аммиачный агар (КАА)
– выявляют микроорганизмы, способные использовать минеральные формы азота.
среда Гильтая
– используют для выявления денитрифицирующих бактерий.
среда Виноградского
– применяется для определения анаэробных азотофиксаторов (Clostridium pasterianum).
Также используют метод обрастания комочков
для выявления численности определенных групп микроорганизмов:
— для выявления аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов раскладывание комочков производится на среде Гетченсона
.
— для выявления аэробных азотофиксаторов (в т.ч. Azotobacter) – на среде Эшби
.
Приготовление почвенной суспензии
: 10г почвы помещают в колбу емкостью 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды, интенсивно взбалтывают вращательным движением (не смачивая пробки) 10 мин. Затем методом разведения готовят суспензии, содержащие разное количество почвы: из предыдущего разведения стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии в пробирку, содержащую 9 мл воды. В первой пробирке 1 мл суспензии, приготовленной по этому методу, соответствует разведению 10-1
.
Из полученных разведений делают посев на жидкие и плотные питательные среды.
Если численность отдельных групп микроорганизмов в почве небольшая, их выявляют методом обрастания комочков почвы.
2.Результаты опыта. Учет численности микроорганизмов различных групп.
2.1. Учет количества микроорганизмов на плотных средах.
Качественная и количественная оценка
микроорганизмов на МПА.
После инкубации чашки с засеянными средами вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний, которые отражают число живых клеток микроорганизмов в почве.
| образец
|
разведение
|
Количество колоний в чашке
|
Число микробных клеток/г почвы
|
| Дерново-подзолистая почва |
10-4
|
136
|
3549*103
|
Число клеток в 1г воздушно – сухой почвы:
Х = =
| Общее количество микроор- ганизмов |
Кол-во бацилл |
% бацилл от общего кол-ва микроор- ганизмов |
Кол-во микобак- терий |
% мико- бактерий от общего кол-ва микроорганизмов |
Качественная и количественная оценка
микроорганизмов на КАА.
| образец
|
разведение
|
Количество колоний в чашке
|
Число микробных клеток/г почвы
|
| Дерново-подзолистая почва |
10-3
|
176
|
1408*103
|
Число клеток в 1г воздушно – сухой почвы:
Х= --------------------------------
Доминирующие формы:
МПА
КАА
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
2.2. Учет количества микроорганизмов на жидких средах.
При определении численности микроорганизмов на жидких средах пробирки ставят в штатив и отмечают те из них, в которых наблюдается развитие микроорганизмов данной группы.
При расчете в соответствии с требованиями необходимо составить числовую характеристику из трех цифр. Первая цифра соответствует числу параллельно засеянных пробирок (отмечается последнее разведение, в котором рост микроорганизмов наблюдается во всех параллельных пробирках). Следующие две цифры обозначают число пробирок, в которых отмечается развитие микроорганизмов в последующих двух разведениях.
Среда Виноградского
выделяет анаэробных азотофиксаторов. Рост наблюдается по изменению окраски с малиновой на желто – оранжевую, появлению мути и пузырьков воздуха.
| Образец почвы
|
Разведение
|
|||||
| 1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
|
| Дерново -подзолистая |
+ + |
+ + |
+ – |
– – |
– – |
– – |
Обработка результатов по таблице Мак – Креди:
| Числовая характеристика |
Количество клеток МО в 1г сухой почвы |
| 200 |
324,6 |
_________________________
_________________________
Среда Гильтая
выделяет денитрификаторов. Рост наблюдается, т.к. появляются пузырьки и муть.
| Образец почвы
|
Разведение
|
|||||
| 1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
|
| Дерново -подзолистая |
+ + |
+ + |
+ + |
+ + |
+ + |
– – |
Обработка результатов по таблице Мак – Креди:
| Числовая характеристика |
Количество клеток МО в 1г сухой почвы |
| 200 |
324 675,3 |
_________________________
_________________________
2.3.Выявление численности отдельных групп микроорганизмов методом обрастания комочков.
Для учета аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов используют среду Гетченсона.
О развитии колоний говорит обрастание комочков.
| Образец почвы |
Количество комочков в чашке |
Количество обросших комочков |
% обросших комочков от общего числа |
| Дерново - подзолистая |
30 |
Среда Эшби
используется для аэробных азотофиксаторов. Наличие таковых характеризуется появлением вокруг комочков слизи (блестящего налета).
| Образец почвы |
Количество комочков в чашке |
Количество обросших комочков |
% обросших комочков от общего числа |
| Дерново - подзолистая |
30 |
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Звягинцев Д. Г., Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. М., изд-во МГУ, 2005 год.
2. Емцев В. Т. Микробиология. М., изд-во «Дрофа», 2005 год
3. Мишустин Е. Н., Емцев В. Т. Микробиология. М., Агропромиздат, 1987 год.
4. Мишустин Е. Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. М., изд-во «Наука», 1972.
5. Растениеводство/под ред Г. С. Посыпанова. М., изд-во «Колос», 1997
6. Ягодин Б.А., Смирнов П. В., Демин В. А., и др. Агрохимия. М., Агропромиздат, 1988 год
7. Ягодин Б. А., Жуков Ю. П., Кобзаренко В. И. Агрохимия М., изд-во «Мир», 2004 год.