Московский Государственный Университет
им. М. В. Ломоносова.
Факультет биоинженерии и биоинформатики.
Наталья Ильинична
Захарова.
Поиск белков с двучастичным сигналом ядерной локализации, расщепляемых каспазами при апоптозе.
/Курсовая работа/.
Научный руководитель:
ст.н.с. НИИФХБ им.
А.Н.Белозерского МГУ
к.х.н. А.Г. Евстафьева
Лаборатория молекулярной биологии гена.
Москва 2003.
Аннотация
В настоящее время весьма бурное развитие получило направление молекулярной биологии, которое занимается изучением процесса программируемой клеточной смерти (апоптоза). Стало очевидным, что для всего организма в целом смерть клетки также важна, как и её деление. С помощью программы апоптоза удаляются инфицированные, повреждённые и избыточные клетки. Ключевым исполнителем прграммируемой смерти являются каспазы - семейство цистеиновых протеиназ, активируемых в процессе апоптоза и гидролизующих белки-мишени после остатка аспарагиновой кислоты в специфических участках их узнавания. Известно уже довольно много белков, фрагментируемых каспазами, принимающих участие в делении клеток, передаче сигналов, регуляции транскрипции и поддержании клеточной структуры. Способность этих белков расщепляться каспазами была в большинстве случаев обнаружена случайно и позволила по-новому взглянуть на их роль в клетке и сформулировать представления о взаимосвязи и регуляции процессов клеточного деления и смерти. Однако есть все основания считать, что известные белки-мишени – лишь верхушка айсберга, и что существует ещё много белков, расщепление которых каспазами может быть необходимо для выполнения программы клеточной смерти, и идентификация которых могла бы существенно расширить представления об их функциях и механизмах реализации этой программы.
Целью настоящей работы является поиск ядерных белков, являющихся мишенями каспаз и имеющих двучастичный сигнал ядерной локализации.
Введение
Апоптоз (программируемая клеточная смерть) является фундаментальным процессом в многоклеточных организмах, позволяющим избавляться от избыточных, повреждённых и инфицированных клеток. Этот процесс вызывается различными стимулами, такими как: цитокины, гормоны, вирусные инфекции и токсичные воздействия на клетку. Первоначальное определение апоптоза было морфологическим: погибающие клетки весьма характерным образом внешне изменяются: происходит уменьшение объёма клетки, активное впячивание внешней мембраны, конденсация хроматина и т.д. Эти видимые изменения обусловлены большим количеством биохимическим изменений, происходящих как на поверхности клетки, так и внутри её. На внешней стороне клеточной мембраны экспонируются различные соединения (такие как фосфатидилсерин), провоцирующие узнавание погибающей клетки фагоцитами. Внутри клетки происходит деградация хромосомной ДНК и специфический протеолиз основных жизненно важных полипептидов. Гидролиз данных белков (белковых субстратов) осуществляется семейством специфических цистеиновых протеаз, гидролизующих полипептиды после остатка аспарагиновой кислоты, называемых каспазами.
Как отмечалось выше, каспазы являются основными исполнителями программы апоптоза. Можно задать ряд вопросов: каким образом они это
Таблица 1. Полипептиды, расщепляемые каспазами при апоптозе.
| Полипептиды |
Сайт расщепления |
Узнающая каспаза |
Предполагаемый эффект расщепления |
| Цитоплазматические белки Гелсолин Gas-2 Фодрин(АльфаII-спектрин) b-Катенин Цитокератин 18 |
DQTD/G SRVD/G DETD/S DSLD/S ? VEVD/A |
3 ? 3 3 3,6,7 |
Кальций-независимое расщепление актина Разупорядочение цитоскелета Выворачивание плазматической мембраны Связывание a-Катеина и межклеточный контакт ? |
| Ядерные белки ЛаминА ЛаминВ1
NuMA
Белки С1
70К белок U1 мяРНП mdm2 |
VEID/N VEVD/S ? ? DGPD/G DVPD/C |
6 6,?3 3,6 3 3 3,6,7 |
Диссоциация тонкого ядерного слоя Изменения в форме ядра Нарушение процессинга РНК То же Неизвестен, начинает связываться с р53 |
| Белки метаболизма и репарации ДНК PARP DNA-PKcs Большая субъединица репликативного фактора С Топоизомераза I |
DEVD/G DEVD/N DEVD/G DDVD/Y |
3,7,9 3 3 3 |
¯Синтеза поли-(ADP-рибозы) ¯Активности N-концевой фрагмент ингибирует рапликацию ДНК Неизвестен |
| Протеинкиназы PKCd PKCt PKN Mst1-киназа Mst2-киназа |
DMQD/M DEVD/K LGTD/S DEMD/S DELD/S |
3 3 3 ? ? |
Активация киназы Активация киназы Активация киназы Активация киназы Активация киназы |
| Другие белки, вовлечённые в передачу сигналов и экспрессию генов Про-интерлейкин-1b Про-интерлейкин-16 Про-интерлейкин-18 IkB NFkB p50, p56 Цитозольная фосфолипаза А2
|
FEAD/G YVHD/A SSTD/S LESD/N DRHD/S ? DELD/A MELD/G |
1 3 1 3 3 3 3 |
Активируется воспалительный ответ клетки Хемотаксис Т-лимфоцитов Индуцирует синтез интерферона g Генерируется ингибитор NFkB ¯NFkB-зависимая транскрипция Активация ¯Транскрипции после интерферона a или g |
| Белки, вовлечённые в регуляцию клеточного цикла и деления клеток p21waf
p21kip
CDC27 Протимозин a |
DHVD/L DPSD/S ? DDVD/D |
3,7 3,7 3 3,7 |
Удаление N-концевого cdk-ингибиторного домена из ядер ¯р27 в циклин E-cdk комплексе Стабилизирует циклины А и В Теряет ядерную локализацию |
| Белки, вовлечённые в генетические заболевания человека Хантигтон Пресенелин-1 Пресенелин-2 |
DSVD/L ARQD/S DSYD/S |
3,7 ? 3 |
Возможно нефизиологическое расщепление Неизвестен Генерирует антиапоптотические фрагменты |
| Апоптотические регуляторные белки Bcl-2 Bcl-XL
|
DAGD/V HLAD/S LQTD/G LEVD/G FIQD/R DEPD/S |
? 1,3 8 3,8,10 ? 3 |
Генерирует проапоптотические фрагменты То же То же Неизвестен Неизвестен Освобождает активную CAD эндонуклеазу |
делают, какие белковые субстраты узнают и расщепляют и насколько велико количество этих субстратов?
Каспазы являются весьма селективным ферментами. Действительно, не так много полипептидов являются субстратами для каспаз. Каспазы расщепляют ключевые структурные компоненты цитоскелета и ядер, белки репарации и метаболизма, белки, участвующие в передаче сигнала, протеинкиназы. В таблице 1 показаны полипептиды, расщепляемые каспазами в ходе апоптоза, указаны, если известно, сайты гидролиза, узнающая каспаза и предполагаемый эффект. Хотя многие полипептиды расщепляются клетками при апоптозе, существует несколько особенностей их деградации, на которые нельзя не обращать внимания. Во-первых, многие субстраты расщепляются позже и менее полно, чем остальные. Важность такого явления в процессе апоптоза остаётся пока неясной. Во- вторых, некоторые субстраты могут расщеплятся только в определённых типах клеток. Актин, например, гидролизуется в клетках U937(больных лейкемией), нейронах и тимоцитах, но не в одном другом типе клеток такого процесса не наблюдается. В-третьих, различные субстраты разрезаются по разным сайтам в различных типах клеток. Так, топоизомераза I в раковых апоптотических клетках легкого А549 имеет сайт расщепления каспазой, отличный от участка её расщепления в
Не все расщепляемые полипептиды подвергаются действию каспаз, так как в ходе апоптоза активируются и другие классы протеаз. Сериновая протеиназа А24 и цистеиновая протеиназа катепсин B также активируются в ходе апоптоза. Калпаины также активируются апоптотическими сигналами, но только в некоторых типах клеток. Эти протеазы имеют свои собственные субстраты, но гидролизуют и некоторые каспазные. Калпаин, например, расщепляет в ходе апоптоза актин, не смотря на способность каспаз in vitro делать тоже самое. Определить же какие из этих субстратов действительно каспазные in vivo, а какие нет, довольно затруднительно. Так, при использовании ингибиторов каспаз in vivo их концентрация может оказаться слишком высокой для других клеточных протеаз, активируемых в процессе апоптоза, тем самым, вызывая их ингибирование.
Материалы и методы
Поиск проводился в базе данных SwissProt посредством программы ProSite. Он был ограничен белками, представленными в живых организмах из класса Mammalia. Для нахождения именно ядерных белков использовался консенсус двучастичного сигнала ядерной локализации (NLS):
[KR]-[KR]-……………-[KR]-[KR]-x-[KR].
Поиск проводился по потенциальному сайту расщепления каспазами 3 и 7:
D-x-x-D.
Таким образом, получились следующие программы поиска:
1) [KR]-[KR]-x(0,9)-D-x-x-D-{P}-x(0,9)-[KR]-[KR]-x-[KR];
2) [KR]-[KR]-x(0,9)-D-x-x-D-{P}-x(0,9)-[KR]-x-[KR]-[KR];
3) D-x-x-D-x(0,9)-[KR]-[KR]-x(10,20)-[KR]-[KR]-x-[KR];
4) [KR]-[KR]-x(10,20)-[KR]-[KR]-x-[KR]-x(0,10)-D-x-x-D.
Результаты и обсуждение
1.
Результаты поиска по патерну 1(см. Материалы и методы).
Все найденные белки можно разделить на группы по их функциям и месту локализации.
Большая часть найденных белков является, как и следовало ожидать, ядерными:
CB80(human), CBF(human), CBX1(human), CND2(human), E2F6(human), DPD3(mouse), HES2(mouse), LA(bovin, human, mouse), MCM2(human), NCO5(human, mouse), NOP5(human, rat), NPL3(human), POL2(mouse), PPAR(canfa, cavpo, human, mouse, rat), PPAT( bovin, crigr, human, macmu, mouse, pig, rabit, rat), PR16(human), RXRA(human, mouse, rat), RXRB(human, mouse, rat), RXRG(human, mouse), SOX8(human, mouse), SOX9(human, pig), SP10(mouse, muscr), SX10(human, mouse, rat), SX15(human, mouse), THYA(bovin, human, mouse, rat), TOP1(crigr, human, mouse), XPB(human, mouse).
Но есть ряд белков, основная функция которых осуществляется в цитоплазме: DYI1(human, mouse, rat), NOX1(human), IF2B(human, mouse, rabit), IF3A( human, mouse), и даже в клеточной мембране: А1А3(human), А2A2(human), CCAA(mouse, rabit, rat), CD3Z( human, pig, rabit).
Следует отметить, что неядерная функция белка не исключает возможности существования у этого белка NLS. Так, известно, что фактор инициации трансляции IF2B осуществляет свою основную функцию в цитоплазме клетки. Однако в нашей лаборатории было показано, что его N-концевая часть содержит сигнал, направляющий белки в ядро. Следовательно, все найденные в процессе поиска белки представляют интерес и должны подвергнуться дальнейшему анализу.
Найденные в процессе нашего поиска белки выполняют самые разные функции в клетке:
1) Ревертазы
:
POL2(mouse), LIN1(human).
2) ДНКтопоизомеразы
:
TOP1(crigr, human, mouse).
3) Хеликазы
:
XPB(human, mouse).
4) Ферменты
:
GL6S(caphi, human), NOX1(human), PPOL(bovin, crigr, human, mouse, rat), XRN2(human, mouse).
5) Белки
сплайсинга
:
CB80(human), PR16(human).
6) Факторы
транскрипции
:
CBF(human), E2F6(human), HES2(mouse), SOX8(human, mouse), SOX9(human, pig), SX10(human, mouse, rat), SX15(human, mouse).
7) Факторы
трансляции
:
IF2B(human, mouse, rabit), IF3A( human, mouse).
8) Белки
хроматина
:
СBX1(human), CND2(human).
9) Киназа
:
NIPK(human, mouse, rat).
10) Протеинкиназы
:
CRK7(human), PR4B(human, mouse), STK3(human).
11) ДНК-полимеразы
:
DPD3(mouse).
12) РНК-полимеразы
:
RPC4(human, mouse).
13) Факторы роста
:
HGFL(human).
14) Белки теплового шока
:
HS7C(crigr).
15) Рецепторы(в том числе, ядерные рецепторы):
IP3R(bovin, human, mouse, rat), PPAR(canfa, cavpo, human, mouse, rat), PPAT(bovin, crigr, human, macmu, mouse, pig, rabit, rat), RXRA(human, mouse, rat), RXRB( human, mouse, rat), RXRG(human, mouse), SRPR(human).
16) белки, имеющие отношение к апоптозу
:
APL3(human), NIPK(human, mouse, rat), REQU(human, mouse), SON(human, mouse).
Среди этих белков есть те, о которых точно известно, что они являются мишенями каспаз: TOP1, PPOL, THYA, IF2B, CB80 , причём то, что последние два белка являются субстратами каспаз было предсказано в нашей лаборатории на основании описанного алгоритма и затем подтверждено экспериментально. Это свидетельствует о том, что алгоритм поиска не лишён разумности. Остальные белки, найденные в настоящей работе, должны быть дополнительно проанализированы.
С нашей точки зрения наибольший интерес представляют белки, являющиеся ядерными рецепторами (Peroxisome proliferator activated receptor alpha(PPAR), Peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAT), Retinoic acid receptor RXR-alpha (RXRA), Retinoic acid receptor RXR-beta (RXRB)). Во-первых, они играют важную роль в передаче сигналов к ядру (поэтому мы можем предположить, что после расщепления таких белков каспазами, клетка нормально функционировать уже не сможет). Во-вторых, мотив “каспазный сайт внутри двучастичного NLS “ консервативен у этих рецепторов, т.е. он есть у соответствующего белка человека, быка, мыши, свиньи, кролика, крысы и т.д. Поэтому, вероятность, что этот мотив имеет функциональное значение, выше, чем у других найденных нами белков.
2.
По патерну 2 (см. Материалы и методы) было найдено 145 белков, но только 43 из них оказались новыми по сравнению с поиском по патерну 1.
Наибольший экспериментальный интерес для нас представляют те белки, в которых в большей степени консервативен мотив «каспазный сайт внутри двучастичного NLS». Это 6 белков: Beta-arrestin 1(ARR1, human, rabbit, rat), Beta-arrestin 2(ARR2, bovin, human, mouse, rat), DNA ligase 1 (DNL1, human, mouse, rat), Transcription factor 4 (ITF2, human, dog, mouse, rat), Probable U3 small nucleolar RNA-associated protein 11(UT11, human, mouse, rat), Cytochrome P450 4B1 (CP4B, human, mouse, rabbit, rat).
Показано, что из них ядерными являются DNL1, UT11 и ITF2; расщепление каспазой внутри NLS должно приводить к изменению внутриклеточной локализации этих белков.
Относительно ARR1 и ARR2 известно, что, хотя оба являются в основном цитоплазматическими, они бывают в ядре, и за ядерную локализацию отвечает
N-концевой домен (аминокислоты 1-185) – тот самый, в котором находиться интересующий нас мотив (аминокислоты 24-53). Про Beta-arrestin 2(ARR2) есть данные, что он шатлирует между цитоплазмой и ядром; если при апоптозе действительно отщепляется его N-концевой пептид, содержащий часть NLS, то шатлирование станет невозможным.
Шестой белок, CP4B, ядерным не является – он заякорен в эндоплазматическом ретикулуме, поэтому мы его из списков белков-кандидатов исключаем.
3.
В поисках по патерну 3 и 4 (см. Материалы и методы) мы искали белки, у которых сайт расщепления каспазой находится не внутри двучастичного NLS, а справа или слева от него. При расщеплении каспазой таких белков двучастичный NLS остался бы целым, и один из фрагментов белка своей ядерной локализации бы не потерял. Вопрос в том, с функциональной частью белка останется NLS или наоборот, функциональный фрагмент белка NLS потеряет. На наш взгляд разумнее исследовать белки, у которых при расщеплении NLS оставался бы с меньшей половинкой, таким образом, большая часть белка теряла бы свою ядерную локализацию. По такому принципу мы отобрали белки, наиболее интересные для экспериментальной проверки: DNA polymerase alpha catalytic subunit (DPOA), Inhibitor of nuclear factor Kappa B kinase beta subunit (IKKB), Ras GTPase-activating protein 1 (RSG1), c-GMT-specific 3’, 5’-cyclic phosphodiesterase alpha’-subunit(CN5A), Dual-specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinase 1A (DYRA), Tropomyosin 1 alpha chain (TPM1).
Выводы
Следующую группу белков можно считать перспективными кандидатами для дальнейшего анализа, в том числе для экспериментальной проверки расщепления этих белков по найденным в настоящей работе сайтам в процессе апоптоза: PPAR, PPAT, RXRA, RXRB, ARR1, ARR2, DNL1, ITF2, UT11, DPOA, IKKB, RSG1, CN5A, DYRA, TPM1.
План дальнейшей работы
1) Экспериментальная проверка наиболее интересных белков.
Список литературы
1. Green, D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin. (2000). Cell, 102: 1-4.
2. Blajersky A.L., Kaufmann S.H. Methods for detecting proteolysis during apoptosis in intact cells.
3. Görlich D., Mattaj W. Nucleocytoplasmic transport. (1996). Science, 271: 1513- 1518.
4. Dingwall C., Laskey R.A. Nuclear targering sequences – a concensus? (1991). Trends Biochem. 16: 478-481.
5. Wang P., Wu Y., Ge X., Ma L., Pei G. Subcellular localization of beta-arrestin is determine their intact N domain and the nuclear export signal at C terminus.(2003).
J BiolChem.