В 1850 г. Пастер установил, что виноградная кислота состоит из двух изомерных форм, имеющих одну и ту же химическую формулу, но кристаллизующихся в виде кристаллов, формы которых относятся друг к другу, как несимметричный предмет к своему зеркальному отображению. Эти формы отличаются друг от друга определенным физическим признаком, именно, - противоположным вращением плоскости поляризации. Явление это было объяснено Вант-Гоффом в 1874 г. с точки зрения пространственного расположения атомов.
Пастер установил, что плесневый гриб Penicillium glaucum,
развиваясь на растворах виноградной кислоты, в первую очередь потребляет одну из двух форм, именно правовращающую, встречающуюся в виде естественного продукта. От изомерии виноградной кислоты он перешел к изомерии амиловых спиртов, образующихся при спиртовом брожении. Это заставило его обратиться к изучению брожений и их природы.
В 1855 г. Пастер обнаружил, что сырой амиловый спирт брожения состоит из двух химически тождественных амиловых спиртов: оптически неактивного и способного вращать плоскость поляризованного света. Уже в прежних своих кристаллографических исследованиях Пастер пришел к обобщению, что оптически активные вещества свойственны только органическому миру и их образование связано с процессом жизни. Отсюда Пастер сделал логическое заключение, что и оптически активный амиловый спирт возникает в процессе брожения при участии живого организма. Если это верно, то брожение есть процесс, связанный с жизнью, сам же фермент должен быть живым организмом. В результате длинного ряда блестящих исследований Пастером была создана теория брожения.
Сам Пастер говорит: "Вовлеченный, даже, вернее сказать, вынужденный логическим развитием моих исследований, я перешел от кристаллографии и молекулярной химии к изучению возбудителей брожения".
Поскольку фрукты сбраживаются в своем натуральном состоянии, брожение появилось раньше человеческой истории. Однако, люди с некоторых пор научились контролировать процесс брожения. Есть веские доказательства того, что люди сбраживали напитки в Вавилоне около 5000 г. до н.э. , в Древнем Египте около 3000 г. до н.э. , в доиспанской Мексике около 2000 г. до н.э. и в Судане около 1500 г. до н.э. Также существуют данные о дрожжевом хлебе в Древнем Египте около 1500 г. до н.э. и сбраживания молока в Вавилоне около 3000 г. до н.э. Китайцы, вероятно, первыми стали сбраживать овощи.
Жизнь микробов возможна и без доступа кислорода воздуха. Энергия, необходимая для жизнедеятельности организма, в этих условиях образуется в результате процессов брожения. Наиболее распространены виды брожений, в процессе которых происходит распад органических веществ (преимущественно Сахаров) под влиянием микроорганизмов, представляющий совокупность окислительно-восстановительных реакций. Брожения никогда не приводят к полному окислению органических веществ. Многие характерные формы брожения протекают без участия кислорода воздуха - анаэробно.
Поскольку свободный кислород, имеющийся на нашей планете, образовался в результате фотосинтеза, возникшего на более поздних этапах развития жизни на Земле, совершенно очевидно, что анаэробный способ извлечения энергии - брожение - более древний, чем процесс дыхания.
Брожение известно людям с незапамятных времен. Тысячелетиями человек пользовался спиртовым брожением при изготовлении вина. Еще раньше было известно о молочнокислом брожении. Люди употребляли в пищу молочные продукты, готовили сыры. При этом они не подозревали, что эти процессы происходят с помощью микроорганизмов. Термин "брожение" был введен голландским алхимиком Ван Хельмонтом в XVII в. для процессов, идущих с выделением газов (fermentatio - кипение). Затем в XIX в. основоположник современной микробиологии Луи Пастер показал, что брожение является результатом жизнедеятельности микробов, и установил, что различные брожения вызываются разными микроорганизмами.
Спиртовое брожение - это процесс окисления углеводов, в результате которого образуются этиловый спирт, углекислота и выделяется энергия.
Сбраживание сахаров известно с глубокой древности. В течение столетий пивовары и виноделы использовали способность некоторых дрожжей вызывать спиртовое брожение, в результате которого сахара превращаются в спирт.
Брожение производят главным образом дрожжи, а также некоторые бактерии и грибы. В различных странах для получения спирта используют различные микроорганизмы. Например, в Европе используют в основном дрожжи из рода Saccharomyces, в Южной Америке - бактерии Pseudomonas lindneri, в Азии - мукоровые грибы.
Сбраживаться могут лишь углеводы, и притом весьма избирательно. Дрожжи сбраживают только некоторые 6-углеродные сахара (глюкозу, фруктозу, маннозу).
Схематично спиртовое брожение может быть изображено уравнением
C6
H12
O6
- > 2C2
H5
OH + 2CO2
+ 23,5×104
дж
глюкоза - > этиловый спирт + углекислота + энергия
Процесс спиртового брожения - многоступенчатый, состоящий из цепи химических реакций. Превращения глюкозы до образования пировиноградной кислоты происходят так же, как и при дыхании. Эти реакции происходят без участия кислорода (анаэробно). Далее пути дыхания и брожения расходятся.
При спиртовом брожении пировиноградная кислота превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Эти реакции протекают в две стадии. Сначала от пирувата отщепляется СО2 и образуется уксусный альдегид; затем уксусный альдегид присоединяет водород, восстанавливаясь в этиловый спирт. Все реакции катализируются ферментами. В восстановлении альдегида участвует НАД·H2
.
Обычно при спиртовом брожении, кроме главных продуктов, образуются побочные. Они довольно разнообразны, но присутствуют в небольшом количестве: амиловый, бутиловый и другие спирты, смесь которых называется сивушным маслом - соединение, от котерого зависит специфический аромат вина. Образование побочных веществ связано с тем, что превращение глюкозы частично идет другими путями.
Биологический смысл спиртового брожения заключается в том, что образуется определенное количество энергии, которая запасается в форме АТФ, а затем расходуется на все жизненно необходимые процессы клетки.
Молочнокислое брожение. При молочнокислом брожении конечным продуктом является молочная кислота.
С этим брожением люди знакомы издавна. Сквашивание молока, приготовление простокваши, кефира, квашение овощей - результаты молочнокислого сбраживания сахара молока или углеводов растений. Этот вид брожения осуществляется с помощью молочнокислых бактерий, которые подразделяются на две большие группы (в зависимости от характера брожения): гомоферментативные, образующие из сахара только молочную кислоту, и гетероферментативные, образующие, кроме молочной кислоты, спирт, уксусную кислоту, углекислый газ.
Гомоферментативное молочнокислое брожение вызывают бактерии рода Lactobacillus и стрептококки. Они могут сбраживать различные сахара с 6-ю (гексозы) или 5-ю (пентозы) углеродными атомами, некоторые кислоты. Однако круг сбраживаемых ими продуктов ограничен.
У молочнокислых бактерий нет ферментативного аппарата для использования кислорода воздуха. Кислород для них или безразличен, или угнетает развитие.
Молочнокислое брожение может быть описано уравнением:
C6
H12
O6
- > 2CH3
·CHOH·COOH + 21,8×104
дж глюкоза - > молочная кислота + энергия, Св
Н12
О6
- > 2CH8
-CHOH-COOH+21,8-104 дж.
Процесс образования молочной кислоты чрезвычайно близок к процессу спиртового брожения. Глюкоза также расщепляется до пировиноградной кислоты. Но затем ее декарбоксилирование (отщепление CO2
), как при спиртовом брожении, не происходит, так как молочнокислые бактерии лишены соответствующих ферментов. У них активны дегидрогеназы (НАД). Поэтому пировиноградная кислота сама (а не уксусный альдегид, как при спиртовом брожении) принимает водород от восстановленной формы НАД и превращается в молочную кислоту. В процессе молочнокислого брожения бактерии получают энергию, необходимую им для развития в анаэробных условиях, где использование других источников энергии затруднено.
Гетероферментативное молочнокислое брожение - процесс более сложный, чем гомоферментативное: сбраживание углеводов приводит к образованию ряда соединений, накапливающихся в зависимости от условий процесса брожения. Одни бактерии образуют, помимо молочной кислоты, этиловый спирт и углекислоту, другие - уксусную кислоту; некоторые гетероферментативные молочнокислые бактерии могут образовывать различные спирты, глицерин, маннит.
Гетероферментативное молочнокислое брожение вызывают бактерии рода Lactobacterium и рода Streptococcus. Химизм этих брожений изучен не так хорошо, как спиртового или гомоферментативного молочнокислого брожения.
Гетероферментативные бактерии образуют молочную кислоту иным путем. Последняя стадия - восстановление пировиноградной кислоты до молочной - та же самая, что и в случае гомоферментативного брожения. Но сама пировиноградная кислота образуется при ином расщеплении глюкозы - гексозомонофосфатном. Выход энергии гораздо меньше, чем при спиртовом брожении.
Гетероферментативные бактерии сбраживают ограниченное число веществ: некоторые гексозы (причем определенного строения), пентозы, сахароспирты и кислоты.
Молочнокислое брожение широко используется при выработке молочных продуктов: простокваши, ацидофилина, творога, сметаны. При производстве кефира, кумыса наряду с молочнокислым брожением, вызываемым бактериями, имеет место и спиртовое брожение, вызываемое дрожжами. Молочнокислое брожение происходит на первом этапе изготовления
Молочнокислые бактерии нашли широкое применение при консервировании плодов и овощей, в силосовании кормов. Чистое молочнокислое брожение применяется для получения молочной кислоты в промышленных масштабах.
Молочная кислота находит широкое применение в производстве кож, красильном деле, при выработке стиральных порошков, изготовлении пластмасс, в фармацевтической промышленности и во многих других отраслях. Молочная кислота также нужна в кондитерской промышленности и для приготовления безалкогольных напитков.
Маслянокислое брожение. Превращение углеводов с образованием масляной кислоты было известно давно. Природа маслянокислого брожения как результат жизнедеятельности микроорганизмов была установлена Луи Пастером в 60-х годах прошлого века.
Возбудителями брожения являются маслянокислые бактерии, получающие энергию для жизнедеятельности путем сбраживания углеводов. Они могут сбраживать разнообразные вещества - углеводы, спирты и кислоты, способны разлагать и сбраживать даже высокомолекулярные углеводы - крахмал, гликоген, декстрины.
Маслянокислое брожение в общем виде описывается уравнением:
C6
H12
O6
- > CH3
·CH2
·COOH + 2CO2
+ 2H2
глюкоза - > масляная кислота
Св
Н12
О6
- > 2CH8
-CHOH-COOH+21,8-104 дж
При этом брожении накапливаются различные побочные продукты. Наряду с масляной кислотой, углекислым газом и водородом образуются этиловый спирт, молочная и уксусная кислоты.
Некоторые маслянокислые бактерии, кроме того, образуют ацетон, бутанол и изопропиловый спирт.
Брожение начинается с процесса фосфорилирования глюкозы и далее идет по гликолитическому пути до стадии образования пировиноградной кислоты. Затем образуется уксусная кислота, которая активируется ферментом. После чего при конденсации (соединении) из двууглеродного соединения получается четырехуглеродная масляная кислота. Таким образом, при маслянокислом брожении происходит не только разложение веществ, но и синтез.
По данным В.Н. Шапошникова, в маслянокислом брожении различаются две фазы. В первой параллельно с увеличением биомассы накапливается уксусная кислота, а масляная кислота образуется преимущественно во второй фазе, когда синтез веществ тела замедляется.
Маслянокислое брожение происходит в природных условиях в гигантских масштабах: на дне болот, в заболоченных почвах, илах и всех тех местах, куда ограничен доступ кислорода. Благодаря деятельности маслянокислых бактерий разлагаются огромные количества органического вещества.
Спиртовое, гомоферментативное молочнокислое и маслянокислое брожения являются основными типами брожений. Все другие виды брожений представляют собой комбинацию этих трех типов. Так, например, пропионовокислое брожение, играющее важную роль при производстве сыров и сопровождающееся накоплением пропионовой и уксусной кислот и углекислого газа, может рассматриваться как комбинация гомоферментативного молочнокислого и спиртового брожений. Брожения клетчатки и пектиновых веществ являются разновидностями маслянокислого брожения.
Итак, три основных типа брожения органически связаны между собой - начальные пути разложения углеводов у них одинаковы.
Процессы дыхания и брожения являются основными источниками энергии, необходимой микроорганизмам для нормальной жизнедеятельности, осуществления процессов синтеза важнейших органических соединений.
Основная польза от брожения - это превращение, например, сока в вино, зерна в пиво, а углеводов в двуокись углерода при брожении хлебного теста.
По Штейнкраузу (Steinkraus; 1995), брожение пищи выполняет пять главных задач:
Обогащение видов пищи разнообразием вкусов, ароматов и текстуры
Сохранение существенного количества пищи с помощью молочной кислоты, алкоголя, уксусной кислоты и щелочного брожения
Биологическое обогащение пищи протеинами, важными аминокислотами, важными жирными кислотами и витаминами
Детоксификация в процессе брожения пищи
Уменьшение времени и затрат на приготовление пищи.
У брожения есть несколько преимуществ, исключительных для пищи. В процессе брожения можно получать важные питательные вещества или устранять непитательные. С помощью брожения пищу можно дольше сохранять, поскольку брожение использует энергию пищи и может создать условия, неподходящие для нежелательных микроорганизмов. Например, при мариновании кислота, получаемая из доминирующей бактерии, препятствует росту всех других микроорганизмов.
Известно, сколь разнообразны продукты, образующиеся при так называемом молочнокислом брожении. Молочная кислота, слизь, маннит, масляная кислота, спирт, углекислота и водород появляются либо одновременно, либо последовательно, и притом в количествах, крайне различных и совершенно произвольных. Растение-фермент, превращающее сахар в молочную кислоту, отлично от того или тех (так как их имеется два), которые вызывают образование слизистого вещества; последние, в свою очередь, не порождают молочной кислоты. С другой стороны, что эти различные растения-ферменты, если они действительно чистые, не могут ни при каких обстоятельствах вызвать появление масляной кислоты. Следовательно, должен существовать особый маслянокислый фермент (возбудитель маслянокислого брожения). Сообщение, которое представлено сегодня Академии, касается как раз происхождения масляной кислоты при так называемом молочнокислом брожении.
Инфузории живущие без свободного кислорода и вызывающие брожение.
Маслянокислым ферментом является инфузория.
Они питаются тем растительным ферментом, который, согласно предположениям, являлся возбудителем маслянокислого брожения и который пытался найти в употребляемых жидких средах. Но не удавалось уловить причину появления масляной кислоты, вытекавшим из исследований совпадением между появлением масляной кислоты и инфузориями и, наоборот, между инфузориями и появлением масляной кислоты. До сих пор это совпадение приписывалось подходящим условиям, которые представляет наличие масляной кислоты для жизни этих маленьких животных.
Многократные опыты убедили в том, что превращение сахара, маннита и молочной кислоты в масляную кислоту обязано исключительно деятельности этих инфузорий и что их-то и надо признать истинными возбудителями маслянокислого брожения.
Вот их описание. Это маленькие цилиндрические обычно прямые палочки с закругленными концами; они встречаются одиночными или соединенными в цепочки из двух, трех, четырех и иногда даже больше члеников. Толщина их равна в среднем 0,002 мм. Длина отдельных члеников варьирует от 0,002 до 0,015 и 0,02 мм. Эти инфузории перемещаются скользящими движениями. Во время такого движения тело их остается прямым или слегка волнообразно изгибается. Они вертятся, покачиваясь, или вызывают быстрое дрожание переднего или заднего конца своего тела. Если длина палочек достигает 0,015 мм, то волнообразность их движений становится очень заметной. Часто они бывают изогнуты на одном конце, иногда же на обоих. Но эта их особенность редко встречается в начале их жизни.
Они размножаются делением. Именно благодаря такому способу размножения некоторые из них принимают вид цепочки. Тог членик, который тянет за собой остальные, производит иногда быстрые движения, как бы пытаясь освободиться от последующих.
Хотя тела этих вибрионов имеют цилиндрическую форму, но часто кажется, что они состоят из ряда зерен или очень коротких, едва намечающихся члеников. Это, без сомнения, первые рудиментарные органы этих маленьких животных.
Эти инфузории можно засевать так же, как засевают пивные дрожжи. Они размножаются, если среда пригодна для их питания. И, что особенно важно отметить, их можно засевать в жидкости, содержащие только сахар, аммиак и фосфаты, т.е. кристаллические и, так сказать, минеральные вещества. В этих жидкостях они размножаются, вызывая в них явно выраженное маслянокислое брожение.
Вес образовавшихся организмов значителен, но, по сравнению с общим количеством образовавшейся масляной кислоты, он ничтожен, как это обычно и бывает со всеми ферментами.
Существование инфузорий, обладающих свойством ферментов (возбудителей брожения), является уже само по себе фактом, весьма достойным внимания. Но к нему присоединяется еще то странное явление, что эти маленькие животные, эти инфузории живут и бесконечно размножаются без того, чтобы явилась необходимость доставлять им хотя бы маленькие количества воздуха или свободного кислорода.
Эти инфузории не только живут без воздуха, но воздух их убивает.
Если пропускать некоторое время через жидкость, где они размножаются, ток чистой углекислоты, то это совершенно не отражается на их жизнедеятельности и размножении. Если же при совершенно таких же условиях заменить на один или два часа ток углекислоты током атмосферного воздуха, то все организмы погибают и маслянокислое брожение, связанное с их существованием, тотчас же останавливается. Мы приходим, следовательно, к двум положениям.
1. Маслянокислым ферментом (возбудителем маслянокислого брожения) являются инфузории.
2. Эти инфузории живут без свободного кислорода. Это первый известный пример фермента животного происхождения, а также и животного, живущего без свободного кислорода.
Сам собой напрашивается вывод о близости образа жизни и свойств этих маленьких животных с образом жизни растительных ферментов в отношении их способности жить без воздуха, а также вытекающих из этого следствий, уясняющих причины брожения. Однако я оставляю за собой право вернуться к идеям, которые вызываются этими новыми фактами, после того как мне удастся осветить их опытом.