М ы Н ы С Т Е Р С Т В О О С В ы Т И У К Р А э Н И ЧЕРКАСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНыВЕРСИТЕТ ьм. Б. ХМЕЛЬНИЦЬКОГО Кафедра органьчною та бьологьчною хьмью ДОСЛыДЖЕННЯ ГЕТЕРОГЕННОСТы БыЛКыВ СИРОВАТКИ КРОВы МЕТОДОМ ЗОНАЛЬНОГО ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ ДИПЛОМНА РОБОТА студента 5 курсу природничого факультету Науковий керьвник доктор бьологьчних наук Ч Е Р К А С И 1996 З М ы С Т. . ВСТУП............................................. 3 . О Г Л Я Д Л ы Т Е Р А Т У Р И. 1.Загальна характеристика бьлкьв кровь............ 6 2.Характеристика бьлкових фракцьй сироваткикровь роздьлених зональним електрофорезом................ 9 3. Змьни бьлкьв кровь при патологью............... 21 . ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА. 1. Матерьали та методи досльдження:............... 25 а) вьдпрацювання методики диск-електрофорезу в ПААГ....................................... 32 б) вьдпрацювання методу радьальною ьмунодифузью................................. 37 2. Результати досльдьв та юх обговорення: а) досльдження гетерогенность бьлкового спектрусироватки кровь в нормальних фьзьологьчних умовах........ 41 б) досльдження гетерогенность бьлкового спектрусироватки кровь при дью ьоньзуючого випромьнювання....... 45 в) досльдження вмсту ьмуноглобульньв сироваткикровь пьд впливом ьоньзуючого випромьнювання............. 51 . ВИСНОВКИ.......................................... 54 . ЛыТЕРАТУРА........................................ 55 . ДОДАТOК........................................... 58 А Н О Т А Ц ы Я. В даньй роботь досльджено вмьст та розподьл бьлковихфракцьй сироватки кровь в нормальних фьзьологьчних умовах тав умовах впливу на органьзм ьоньзуючого випромьнювання. В результать досльджень встановлено, що пьд впливомьоньзуючого випромьнювання спостерьгаються значнь змьнибьлкового спектру кровь внасльдок значного збьльшення гло-бульнових фракцьй ( -, -глобульньзацья) та зменшенняфракцьй альбумьну за рахунок пофракцьйного перерозподьлубьлкьв по типу електрофоретичною гомогеньзацью. Виявлено змьни кьлькьсного вмьсту та якьсного складуьмуноглобульньв сироватки кровь, якь можуть бути використаньу виглядь бьохьмьчних маркерьв при дьагностиць та прогнозу-ваннь перебьгу ряду захворювань. ВСТУП. В даний час особливо велика увага надашться розвитку тавдосконаленню досльджень, спрямованих на з'ясування тапьзнання закономьрностей ь механьзмьв бьохьмьчних, генетич-них, ьмунологьчних основ процесьв життшдьяльность, виясненнювзашмозв'язку мьж структурою важливих компонентьв живих ор-ганьзмьв та юх бьологьчними функцьями. Матерьальну основу всьх процесьв життшдьяльность живихорганьзмьв складають тисячь хьмьчних реакцьй, для яких ха-рактерними ознаками ш висока швидкьсть, певна часова тапросторова скоординованьсть ь взашмозалежньсть. При цьомусльд враховувати, що органьзм людини знаходиться в постьйно-му взашмозв'язку з зовньшньм середовищем ь, як правило, за-знаш закономьрного впливу рьзних факторьв,якь можуть виявля-ти рьзноплановий вплив на певнь сторони обмьну речовин таструктуру ь функцью чисельних компонентьв живих кльтин, вьдяких залежить життшдьяльньсть органьзму. Важливими структурними компонентами живих органьзмьв, зякими ь пов'язань всь прояви юх життшдьяльность, ш бьлки. Цьвисокомолекулярнь азотовмьснь бьопольмери вьдьграють важливуроль в живих органьзмах ь ш основою юх структури та основоюобмьну. З бьлками пов'язань такь процеси, як подразливьсть,скоротливьсть, здатньсть до самооновлення та самовьдтворен-ня, без яких важко уявити живь системи. Враховуючи важливуроль бьлкьв в органьзмь, а також той факт, що бьлки визнача-ють чисельнь важливь функцью живого органьзму та досить чут-ливь до рьзних змьн його стану, досльдження бьлкового спект-ру рьдин та тканин органьзму може складати значний ьнтерес.Це тим бьльше важливо, поскьльки вивчення бьлкового спектруможе допомогти в з'ясуваннь причин, якь сприяють виникненню - 4 -рьзних захворювань ь, в першу чергу, порушення ьмунного ста-тусу органьзму, здатность його до адекватною реакцью навплив несприятливих факторьв хьмьчною, фьзичною чи бьологьч-ною природи. Незаперечним ш той факт, що вмьст загального бьлка табьлкових фракцьй в тканинах ь рьдинах органьзму (сироватцькровь, плазмь, лькворь) ш важливим дьагностичним показникомта показником резистентность органьзму. Це обумовлено тим,що вмьст загального бьлка ь бьлкових фракцьй зазнаш певнихзмьн пьд впливом ендо- та екзогенних факторьв та при за-хворюваннях внутрьшньх органьв та порушеннях обмьну речовин.При цьому спостерьгаються закономьрнь змьни вмьсту бьлкьвта юх фракцьй в рьдинах ь тканинах органьзму. Такими факторами може бути ьоньзуюче випромьнювання,рьзнь хьмьчнь сполуки, ьони метальв, якь потрапляють до ор-ганьзму ьз зовньшнього середовища, а також токсини мькроор-ганьзмьв, що викликають ьнфекцьйнь захворювання та порушеннядьяльность внутрьшньх органьв та систем органьзму. Досльдження та детальне вивчення механьзмьв впливурьзних ендо- та екзогенних факторьв на перебьг метабольчнихпроцесьв в органьзмь маш велике значення особливо в данийчас, поскьльки в результать техногенного та антропогенноговпливу значно погьршився стан довкьлля. За цих умов живь ор-ганьзми, в тому числь ь людина, постьйно знаходяться векстремальних умовах, що зумовлено рьзними чинниками. Це,в першу чергу, значне погьршення екологью пьд впливом техно-генного пресьнгу, аварью на ЧАЕС та ьн. Таким чином, органьзм людини знаходиться в постьйномудвосторонньому зв'язку з зовньшньм середовищем, яке можепроявляти значний вплив на його фьзьологьчнь функцью, обмьнта метабольчнь процеси! Тому з'ясовування механьзмьв впливурьзних ендо- та екзогенних факторьв на обмьннь процеси в ор-ганьзмь ш досить актуальним. - 5 - Метою нашою роботи було досльдження перерозподьлу бьл-кових фракцьй сироватки кровь при рьзному функцьональномустань органьзму, а також пьд впливом певних екзогенних фак-торьв. Для досльдження вмьсту та перерозподьлу бьлкових фракцьйсироватки кровь ми використовували метод дискелектрофорезу впольакриламьдному гель та метод ьмунодифузью. Робота виконувалась на базь лабораторью бьологьчноюхьмью людини та тварин Черкаського державного уньверситетута ьмунологьчною лабораторью обласною лькарнь. - 6 - ОГЛЯД ЛыТЕРАТУРИ. 1. Загальна характеристика бьлкьв кровь. В даний час досльдженням бьлкьв плазми кровь присвяченавелика кьлькьсть льтератури. За даними льтератури, сироватка кровь ш досить складноюсистемою, до якою входить 0,9% неорганьчних та 9,1% ор-ганьчних сполук, серед них важливе мьсце займають бьлки -6 - 8% (7, 24). Молекули бьлкьв - складнь структури, основу яких скла-дають амьнокислотнь посльдовность. Серед них видьляють групипростих (протеюни) та складних (протеюди) бьлкьв. Протеюнискладаються лише з залишкьв амьнокислот, а протеюди мьстятьще й компонент ьншою хьмьчною природи (вуглеводи, льпьди).На цей час в сироватць кровь ьдентифькуються бьльше 100бьлкових молекул. До бьлкьв сироватки кровь вьдносять групубьлкьв, якь: - мьстяться в сироватць кровь; - синтезуються в печинць, або ретикулоендотельальньйсистемь; - виявляють головну функцью в межах шдиною системи; - видьляються в кров; - знаходяться в плазмь в концентрацью бьльшьй, ньж вьнших бьологьчних рьдинах; - можуть проявляти генетично обумовлений польморфьзм; - не ш продуктом катабольчного протеользу. Бьлки - польфункцьональнь сполуки ь виконують в органьзмь безльч функцьй. 1.Транспортна функцья. Завдяки здатность утворюватикомплекси, бьлки приймають участь в перенесеннь сполук, ба- - 7 -гато з яких погано розчиняються, або зовсьм не розчиннь уводь (жирнь кислоти, льпьди, стероюднь гормони). 2.Захисна функцья - збереження постьйною кьлькостькровь в судинному русль при його пошкодженнь (бьлки системизсьдання). 3.Пьдтримка онкотичного тиску кровь. Бьлки не проходятьчерез мембраннь структури капьлярьв, що сприяш затримць водита збереженню кьлькость циркулюючою кровь. 4.Регуляцья концентрацью ьоньв. 5.Створення бьлкових резервьв органьзму, якь забезпечу-ють амьнокислотами мозок, серце та ьншь органи пьд час голо-дування. Враховуючи те, що бьлки визначають чисельнь важливьфункцью живих органьзмьв ь досить чьтко реагують на будь-якьзмьни його стану, в даний час досить велика увага надаштьсявизначенню вмьсту загального бьлка та бьлкових фракцьй прирьзному функцьональному стань органьзму. Це обумовлено тим,що вмьст загального бьлка, а також перерозподьл бьлковихфракцьй сироватки кровь маш важливу дьагностичну цьнньсть,ьнформуш про бьохьмьчнь процеси, якь проходять в органьзмьта вьдкривають можливьсть корекцью рьзних порушень ь ранньоюпрофьлактики (7, 12, 42). Разом з тим, вмьст бьлка в сироватць кровь ш головнимпоказником резистентность органьзму, що важливо в умовахпостьйного впливу ендо- ь екзогенних факторьв на органьзм(7, 25, 42). Сучаснь методи досльдження дають змогу одержати вичерп-ну ьнформацью про стан бьлкового обмьну, встановити певньзакономьрность порушень при розвитку захворювання.Досльджен-ню вмьсту загального бьлка ь бьлкових фракцьй в сироватцькровь присвячено велику кьлькьсть робьт вьтчизняних та за-рубьжних досльдникьв (4, 20, 25, 33, 34). Згьдно з льтера-турними даними бьлки рьдин органьзму герерогеннь ь склада- - 8 -ються з великою кьлькость фракцьй, якь в сумь складають по-казник - загальний бьлок. Бьлковь фракцью визначають рьзнимиметодами: оптичними, титрометричними, седиментацьйними. Склад бьлкьв сироватки кровь дуже складний. Тому будь-яка класифькацья, яка базушться на обмеженьй кьлькость ознакабо на будь-якьй одньй (як в разь електрофорезу) властивостьповинна враховувати промьжнь ступень, що ь складаш враженняневизначеность. В даний час класифькацья бьлкьв кровь ба-зушться на термьнах (наприклад: - глькопротеюд, -льпопротеюд), якь були введень при електрофоретичному тахьмьчному анальзах. В наукових досльдженнях для вивченнявмьсту та розподьлу бьлкових фракцьй сироватки кровь доситьшироко використовують методи зонального електрофорезу нарьзних носьях (папьр, крохмаль, гель). Найбьльш поширенимсеред них ш метод диск-електрофорезу в польакриламьдному ге-ль, який вперше було використано Кендалем в 1923 роць, таметод радьальною ьмунодифузью. Дань методи володьютьзначною дозволяючою здатньстю ь дають змогу виявити в сиро-ватць кровь вьд 6 до 20 фракцьй. - 9 - 2. Характеристика бьлкових фракцьй сироватки кровь, роздьлених методами зонального електрофорезу. Методом зонального електрофорезу, зокрема методомдиск-електрофорезу в польакриламьдному гель в сироватцькровь можна виявити такь основнь фракцью: 1. Альбумьни (преальбумьни, постальбумьни). 2. Глобульни ( , , , , ). Кожна з них ш гетерогенною: утворюш ще по кьлька дугпреципьтацью. Дань вьдносно розподьлу бьлкових фракцьй сиро-ватки кровь роздьлених методом диск-електрофорезу в ПААГпредставлено в таблиць 1. Крьм диск-електрофорезу для фракцьонування бьлкьв сиро-ватки кровь, зокрема бьлкьв - ьмуноглобульньв використовуютьметод ьмунодифузью. Суть цього методу в тому, що в агаровомугель бьлкова сумьш, яка досльджушться, обробляшться спе-цифьчною антисироваткою. Антиген дифундуш в агарь ь утворюшкьльця преципьтацью, в разь чого виникають свошрьднь осади,локальзацья яких дозволяш робити висновки про склад дос-льджуваних бьлкьв. Групи бьлкьв кровь, якь визначаються електрофорезом,розмежовань у фьзьологьчному вьдношеннь. Так, в бьльшостьвипадкьв, альбумьн вьдьграш роль бьлка, який визначашфункцью живлення та пьдтримки осмотичного тиску ь лише по-части приймаш участь в утвореннь комплексьв, якь забезпечу-ють транспорт рьзних сполук. Група - та - глобульньв -це бьлки, якь забезпечують транспорт ь лише частково зв'я-зань з функцьшю ьмуньтету; - глобульни майже повньстюзв'язань з ьмуньтетом ь лише частково з функцьшю транспорту.Ця схема дозволяш дати характеристику функцьям бьлкьв кровь(39). Загальний вмьст бьлка та бьлкових фракцьй в сироватць - 10 -кровь варьюш в широких межах ь залежить вьд багатьох фак-торьв - вьку, фьзьологьчного стану, тощо. За даними ряду авторьв (2, 14, 16, 30, 33, 41) в нор-мальних фьзьологьчних умовах вмьст бьлкових фракцьй пода-ний в таблиць 2. Ми бачимо, що кьлькьсть загального бьлка удьтей лежить у межах 41-79 г/л,у дорослих - 65-85г/л, аль-бумьну у дьтей ь дорослих - 20,5-52 та 56-65 г/л вьдповьдно,кьлькьсть глобульньв складаш: 9,4-42 г/л у дьтей та 31-45г/л у дорослих. Як видно з таблиць, вмьст рьзних бьлкових фракцьйварьюш в широких межах. Функцью та бьологьчна роль бьлковихфракцьй рьзна, так, одньшю з важливих фракцьй, яка шнайбьльш значною в кьлькьсному вьдношеннь та найбьльш од-норьдною, ш фракцья альбумьньв. Зона альбумьньв. Основну частину бьлкьв плазми кровь складають альбумьни(бьльще 50%). Альбумьн - резерв азоту в органьзмь, регулюшколоюдно-осмотичний тиск. Альбумьн складашться з 579 амьнокислотних залишкьв, се-ред яких переважають залишки з негативним зарядом радикалу.Може мьстити в свошму складь певну кьлькьсть вуглеводьв тазначну кьлькьсть дьамьнодикарбонових амьнокислот. Завдякисвошму значному негативному заряду альбумьн може забезпечититранспорт сполук (жирнь кислоти, стероюднь гормони, льпьди).Згьдно з льтературними даними (1, 33, 39) при електрофорезьальбумьн рухашться шдиним фронтом, однак при застосуванньбьльш тонких методьв роздьлення вдашться видьлити кьлькамьнорних фракцьй. Деякь автори вважають, що гетерогенньстьальбумьну за цих умов обумовлена наявньстю адсорбованих найого поверхнь речовин - льганд (33, 34, 39). Велике фьзьоло-гьчне значення маш комплекс альбумьньв з гормонами щитовидноюзалози, стероюдними гормонами, ьнсульном. Альбумьн володьш - 11 -специфьчними центрами, до яких можуть пришднуватись гормони.Рьвень альбумьньв регулюш вмьст вьльних гормоньв в кровь тамьру юх активность, поскьльки гормони, якь зв'язань з альбу-мьном, втрачають свою активньсть ь не можуть проходитичерез мембрани кльтин. Зменшення кьлькость альбумьньв ведедо гормональних порушень. В останньй час встановлено (33), що альбумьни легкопотрапляють в м'язеву тканину, пьдвищують ьнтенсивньстьпроцесьв вьдновлення НАД , окислювального фосфорилювання,генерацью АТФ. Синтез альбумьну здьйснюшться в печьнць. Вмьст його всироватць кровь складаш 35 - 55 г/л. Рьвень альбумьну можезмьнюватися залежно вьд певних умов. Пьдвищення вмьстузустрьчашться рьдко - гьперальбумьнемья. Причиною даногоявища може бути дегьдратацья при зневодненнь органьзму (35,37). Зменшення вмьсту - гьпоальбумьнемья - ш насльдком гемо-делюцью та значних втрат бьлка (видьлення бьлка нирками,шлунково-кишковим трактом), при порушеннь синтезу бьлка(хвороби печьнки, голодування), при пьдвищеннь розкладу аль-бумьну (ьнфекцьйнь хвороби, пухлини). Особливе мьсце з